田 薇，方 延 ，吳晗恬，吉布強(qiáng)，夏昭林

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，新疆烏魯木齊 830011；2.復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，上海 200032；3.山東省臨沂市人民醫(yī)院血液科，山東 臨沂 276100)

急性白血病按照法、美、英分型系統(tǒng)(French-American-British classification systems，F(xiàn)AB)分型，主要分為急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)和急性淋巴細(xì)胞白血病。其中AML是以骨髓和外周血中未成熟骨髓干細(xì)胞惡性增生為特征，并具有高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，發(fā)生機(jī)制尚在研究中。由于AML治愈率不高，且存活率低，治療后存在復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，因此研究和探索其分子生物學(xué)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志極其重要。

近年來長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)逐漸成為表觀遺傳研究熱點(diǎn)。以往認(rèn)為lncRNA 沒有功能，最新研究表明其在基因組中被廣泛轉(zhuǎn)錄并在基因調(diào)節(jié)中起重要作用，lncRNA可能存在序列和空間結(jié)構(gòu)上的異常、表達(dá)水平的異常及與結(jié)合蛋白相互作用的異常等，從而導(dǎo)致基因調(diào)節(jié)異常而發(fā)生疾病。目前l(fā)ncRNA 最重要的發(fā)現(xiàn)是可能與惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān)，不少研究顯示在乳腺癌、肝癌、前列腺癌、肺癌中l(wèi)ncRNA的表達(dá)水平有明顯變化。

LncRNA 在血液腫瘤發(fā)生過程中所起的作用目前尚不清楚，其分子遺傳及表觀遺傳學(xué)機(jī)制還需要進(jìn)一步探討。本研究采用lncRNA 基因芯片篩選AML 患者與健康對(duì)照組人群外周血中差異表達(dá)的lncRNAs 及mRNAs，并對(duì)所篩選出的差異表達(dá)lncRNAs和mRNAs進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)分析和通路分析，探討可能的分子功能及差異表達(dá)基因可能所在的細(xì)胞通路，對(duì)AML中的差異基因進(jìn)行生物信息學(xué)的初步功能分析。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集AML患者及健康對(duì)照組各6例人群外周靜脈血。白血病患者男性4名，女性2名，平均年齡(46.8±9.54)歲；健康對(duì)照組男性4 名，女性2 名，平均年齡(47.5±8.09)歲；兩組選取的樣本年齡和性別匹配。

1.2 RNA提取

經(jīng)知情同意后，取患者及健康對(duì)照組人群外周靜脈血2 mL，常規(guī)分離淋巴細(xì)胞，按照miRNeasy Mini Kit(QIAGEN，GmBH，Germany)說明書抽提總RNA，再經(jīng)NanoDrop ND-2000 分光光度計(jì)(Thermo，US)及 Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent technologies，US)檢測(cè)RNA 的濃度、純度及完整性。樣本

D

(260)/

D

(280)值在1.8～2.1 之間認(rèn)為RNA 樣本質(zhì)量符合要求。檢測(cè)合格的RNA再進(jìn)行芯片實(shí)驗(yàn)。

1.3 lncRNA芯片實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)樣本由上海伯豪生物技術(shù)有限公司采用Agilent 4×180 K lncRNA 芯片(Agilent，US)同時(shí)檢測(cè)lncRNA 和 mRNA，lncRNA 數(shù)目 63 431，mRNA 數(shù)目39 887。質(zhì)檢合格并純化后的總RNA 經(jīng)過熒光標(biāo)記，在滾動(dòng)雜交爐中進(jìn)行芯片雜交，掃描并采集信號(hào)，最終獲得lncRNA及mRNA表達(dá)量。

1.4 差異基因篩選和分析

采用Agilent Microarray Scanner(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，US)，軟件設(shè)置染料通道：綠色Scan resolution=3 μm， PMT 100% ， 20 bit。 用Feature Extraction software 10.7(Agilent technologies，Santa Clara，CA，US) 讀取數(shù)據(jù)，最后采用Gene Spring Software 11.0 (Agilent technologies， Santa Clara，CA，US)進(jìn)行歸一化處理，所用的算法為Quantile。本次實(shí)驗(yàn)設(shè)定差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)為差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)≥2，

P

＜0.05。

1.5 差異基因聚類分析

1.5.1 散點(diǎn)圖繪制

芯片的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理，以2 為底數(shù)取對(duì)數(shù)值后繪制散點(diǎn)圖，用于評(píng)估兩組數(shù)據(jù)總體分布情況。散點(diǎn)圖中的所有點(diǎn)代表芯片上的所有探針，在二維平面中該點(diǎn)的位置由X軸坐標(biāo)和Y 軸坐標(biāo)確定。X 軸表示急性髓性白血病組標(biāo)準(zhǔn)化后點(diǎn)的信號(hào)值，Y 軸表示對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)化后點(diǎn)的信號(hào)值。當(dāng)探針點(diǎn)在兩張芯片中信號(hào)值差異倍數(shù)=1時(shí)，點(diǎn)落在圖形

y

=

x

直線即中位線上方；當(dāng)探針點(diǎn)在兩張芯片中信號(hào)值差異差異倍數(shù)＞2時(shí)，則該點(diǎn)落在圖形中位線兩側(cè)45°線之外。

1.5.2 火山圖繪制

芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行組間比較，通過篩選FC 以及

t

-檢驗(yàn)得到的

P

值來確定顯著性差異的探針。火山圖在同一平面內(nèi)展示了滿足上述兩條件的探針數(shù)目及分布。在火山圖中，縱坐標(biāo)為-lg

P

值。橫坐標(biāo)為log(FC)，正號(hào)代表了基因表達(dá)上調(diào)，負(fù)號(hào)代表基因下調(diào)。

1.5.3 聚類熱圖繪制

對(duì)樣本和基因分別進(jìn)行分級(jí)聚類之后，通過熱圖表現(xiàn)基因在不同樣本中表達(dá)情況的直觀圖形。

1.6 生物信息學(xué)分析

對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO 分析和京都基因和基因組百科全書分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)。將差異表達(dá)基因上傳至數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.geneontology.org)進(jìn)行GO分析，同時(shí)上傳至數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)進(jìn)行KEGG分析預(yù)測(cè)可能的信號(hào)通路。

2 結(jié) 果

2.1 lncRNA芯片結(jié)果

對(duì)完成雜交的12個(gè)樣本芯片進(jìn)行掃描，結(jié)果每張芯片信號(hào)均無邊緣化效應(yīng)，均勻清晰。

2.2 表達(dá)差異基因篩選

結(jié)果顯示，急性髓性白血病組與健康對(duì)照組相比，差異表達(dá)的lncRNA 有3 256個(gè)，其中1 161個(gè)表達(dá)上調(diào)，2 095 個(gè)表達(dá)下調(diào)；差異表達(dá)的mRNA 有3 544 個(gè)，其中1 950 個(gè)表達(dá)上調(diào)，1 594 個(gè)表達(dá)下調(diào)。表達(dá)上調(diào)和下調(diào)各前20位分別見表1和表2。

表1 急性髓性白血病組表達(dá)上調(diào)的lncRNAs和mRNAs(前20位)

表2 急性髓性白血病組表達(dá)下調(diào)的lncRNAs和mRNAs(前20位)

2.3 差異基因分布情況

散點(diǎn)圖見圖1。圖中的每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)探針信號(hào)，X軸為對(duì)照組，Y軸為急性髓性白血病組，X軸和Y 軸數(shù)值分別對(duì)應(yīng)探針信號(hào)在兩組樣本中的強(qiáng)弱，圖中紅色及綠色信號(hào)點(diǎn)表示基因表達(dá)量具有顯著差異的基因?；鹕綀D見圖2。圖中越靠近左下角和右下角的數(shù)據(jù)

P

值越小，F(xiàn)C值越大，差異越顯著。

2.4 差異基因?qū)蛹?jí)聚類

對(duì)白血病組及對(duì)照組篩選出的差異表達(dá)的lncRNAs 及mRNAs 進(jìn)行分級(jí)聚類，結(jié)果見圖3，從圖中可以看到每個(gè)基因在不同分組中的表達(dá)量差異分布。紅色表示表達(dá)上調(diào)，綠色表示表達(dá)下調(diào)。

圖1 LncRNA和mRNA散點(diǎn)圖

圖2 LncRNA和mRNA火山圖

圖3 LncRNA和mRNA聚類熱圖

2.5 生物信息學(xué)分析

與對(duì)照組比較，急性髓性白血病組的差異表達(dá)基因主要富集在化學(xué)刺激感受、有絲分裂細(xì)胞周期的G1/S轉(zhuǎn)變、炎癥反應(yīng)等；差異表達(dá)基因富集的前10個(gè)GO條目見表3，差異基因的所有富集GO條目見圖4。

急性髓性白血病組與對(duì)照組比較的差異表達(dá)基因主要富集在移植物抗宿主反應(yīng)疾病、細(xì)胞循環(huán)及人類嗜T淋巴細(xì)胞病毒I型感染等通路上，差異表達(dá)基因富集的前10 個(gè)通路見表4，差異基因的所有富集通路見圖5。

3 討 論

LncRNA 參與了包括X 染色體沉默、基因組印跡、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程，與細(xì)胞內(nèi)很多生命活動(dòng)密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，如lncRNA HOXA11-AS在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，lncRNA HOTAIR 在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中高表達(dá)，lncRNA KCNMB2-AS1 在胃癌組織中高表達(dá)。多項(xiàng)研究均顯示，腫瘤的發(fā)生與lncRNA異常表達(dá)有關(guān)。史利歡等在體外細(xì)胞試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，lncRNA HIT 可通過抑制QKI 蛋白(Quaking QKI)的表達(dá)進(jìn)而上調(diào) Sox2 及 Oct4 的 mRNA 及蛋白表達(dá)，從而導(dǎo)致人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系SUP-B15對(duì)治療該病的常用藥物伊馬替尼產(chǎn)生藥物抵抗。由此可見，lncRNA在白血病發(fā)生及后續(xù)治療過程均可能產(chǎn)生調(diào)控作用，因此建立白血病lncRNA 差異表達(dá)譜極其重要。

表3 急性髓性白血病與對(duì)照組差異表達(dá)基因富集的前10個(gè)GO條目

圖4 急性髓性白血病組與對(duì)照組差異基因GO分析

表4 急性髓性白血病組與對(duì)照組差異表達(dá)基因富集的前10個(gè)通路

圖5 急性髓性白血病組與對(duì)照組差異基因的KEGG分析

本研究采用lncRNA 基因芯片篩選急性髓性白血病與健康對(duì)照組外周血中l(wèi)ncRNAs和mRNAs的差異表達(dá)。結(jié)果顯示急性髓性白血病組與健康對(duì)照組相比，差異表達(dá)的lncRNA 有3 256個(gè)，其中1 161個(gè)表達(dá)上調(diào)，2 095個(gè)表達(dá)下調(diào)；差異表達(dá)的mRNA有 3 544個(gè)，其中1 950個(gè)表達(dá)上調(diào)，1 594個(gè)表達(dá)下調(diào)。此結(jié)果提示差異表達(dá)基因與急性髓性白血病的發(fā)生可能有關(guān)，但仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探討。

此外，本研究對(duì)篩選出的差異表達(dá)lncRNAs 和mRNAs進(jìn)行了GO分析和KEGG分析。GO分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要富集在化學(xué)刺激感受、有絲分裂細(xì)胞周期的G1/S轉(zhuǎn)變、炎癥反應(yīng)等。表明差異表達(dá)基因在急性髓性白血病的發(fā)生過程中，調(diào)控細(xì)胞有絲分裂過程，對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡產(chǎn)生異常影響，為急性髓性白血病的發(fā)生機(jī)制提供基因水平的依據(jù)。研究顯示，lncRNA可能通過調(diào)控miRNA進(jìn)而對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡起到調(diào)控作用。白血病的發(fā)生與造血干細(xì)胞的增殖和凋亡異常關(guān)系密切。KEGG 分析結(jié)果顯示急性髓性白血病組與對(duì)照組比較的差異表達(dá)基因主要富集在移植物抗宿主反應(yīng)疾病、細(xì)胞循環(huán)及人類嗜T 淋巴細(xì)胞病毒I 型感染等通路上，為后續(xù)研究提供依據(jù)。目前多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)lncRNAs 參與腫瘤發(fā)生相關(guān)的多種信號(hào)通路，如增殖信號(hào)通路、抑癌基因信號(hào)通路、細(xì)胞存活信號(hào)通路、運(yùn)動(dòng)信號(hào)通路等。Trimarchi等研究發(fā)現(xiàn)lncRNA LUNAR1 可能被Notch1 致癌基因誘導(dǎo)從而上調(diào)生長(zhǎng)因子1 的受體表達(dá)，使得細(xì)胞異常增生導(dǎo)致急性淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)生。

綜上所述，惡性血液腫瘤與lncRNA 的異常表達(dá)密切相關(guān)。本文通過對(duì)急性髓性白血病組與健康對(duì)照組差異表達(dá)lncRNAs和mRNAs進(jìn)行篩選，建立了差異表達(dá)lncRNAs 表達(dá)譜；研究結(jié)果為探索急性髓性白血病發(fā)生的新標(biāo)志物及早期診斷提供可靠的線索，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。