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        大黃素對自身免疫性甲狀腺炎小鼠的作用機制研究*

        2021-04-14 00:50:42張國平李攀胡通海吳可人
        中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志 2021年6期
        關鍵詞:小鼠血清模型

        張國平,李攀,胡通海,吳可人

        (1.嵊州市中醫(yī)院 外二科,浙江 嵊州312400;2.浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院肝膽外科,浙江 杭州310000)

        自身免疫性甲狀腺炎(autoimmune thyroiditis,AT)主要是由免疫功能紊亂、環(huán)境及遺傳等因素綜合作用導致的自身免疫性疾病,是細胞免疫與體液免疫共同作用的結果[1-3]。AT 發(fā)病率不斷上升,嚴重影響人們生活質量[4-5]。近年來,臨床上針對AT 主要采用免疫抑制劑、糖皮質激素等治療,但其效果并不十分理想,且對機體免疫功能造成較大損害[6]。而大黃素屬一種蒽醌類衍生物,具有一定的免疫抑制作用。因此,本文研究旨在探討大黃素治療AT 小鼠的作用機制。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物

        60 只SPF 級昆明小鼠,雌性,適應性飼養(yǎng)1 周,濕度(55±10)%,溫度(23±2)℃,自由飲食,購自遼寧實驗動物中心,動物生產許可證號:SCXK2017-0001,動物使用許可證號:SCXK2017-0008。

        1.2 主要試劑和儀器

        大黃素(南京景竹生物科技有限公司,純度98%),小鼠甲狀腺球蛋白抗體(thyroglobulin antibody, TGAb) 和甲狀腺過氧化物酶自身抗體(thyroid peroxidase autoantibody, TPOAb)酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒(上海廣銳生物科技有限公司)。Bio-Rad酶標儀(美國伯樂公司),流式細胞儀(美國BD公司)。

        1.3 動物模型的復制與分組

        1.3.1 模型復制取10 mg 豬甲狀腺球蛋白溶于5 ml 水,將其與完全弗氏佐劑等體積充分混合制成油包水乳劑。取小鼠甲狀腺球蛋白0.5 ml,均勻分布于腹部、背部2 點皮下注射,初次免疫為每個點注射0.25 ml,14 d 后取甲狀腺球蛋白與不完全弗氏佐劑等體積混合,再多點皮下注射,持續(xù)4 周。

        1.3.2 分組60 只小鼠隨機分為正常組、模型組和實驗組,每組20 只。實驗組給予75 mg/kg 大黃素灌胃,1 次/d,持續(xù)8 周;對照組和模型組灌胃等劑量生理鹽水,1 次/d,持續(xù)8 周。

        1.4 方法

        1.4.1 甲狀腺組織形態(tài)觀察取小鼠甲狀腺組織,以生理鹽水清洗,在10%中性甲醛溶液中固定,石蠟包埋,連續(xù)切片,行常規(guī)HE 染色,在顯微鏡下觀察淋巴細胞浸潤情況。

        1.4.2 血清TGAb 和TPOAb 水平檢測各組小鼠摘眼球取血0.3 ml,靜置15 min,2 500 r/min 離心12 min,離心半徑15 cm,取上清液,采用ELISA測定TGAb 和TPOAb 水平,嚴格依據(jù)試劑盒說明書進行操作。

        1.4.3 甲狀腺淋巴細胞浸潤程度評價甲狀腺淋巴浸潤程度=濾泡間浸潤程度+上皮間淋巴浸潤程度。濾泡間浸潤程度評價:(-)為0 分;(±)為1 分;(+)為2 分;(++)為3 分;(+++)為4 分。上皮間浸潤程度:0 個炎細胞/張切片為0 分;1 或2 個炎癥細胞/張切片為1 分;1 個炎細胞/10 個高倍視野為2 分;1 個炎細胞/5 高倍視野為3 分;1 個炎細胞/2 高倍視野為4 分。

        1.4.4 外周血T淋巴細胞亞群檢測各組小鼠摘眼球取血0.3 ml,肝素抗凝,制備成1×107個/ml 單細胞懸液,加入抗體,避光染色30 min,加入溶血素反應10 min,2 500 r/min離心6 min,離心半徑15 cm,棄上清液,加入PBS 溶液洗滌2 次,加入1%多聚甲醛固定,采用流式細胞術測定T 淋巴細胞亞群變化。

        1.5 統(tǒng)計學方法

        數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學軟件。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,比較用單因素方差分析,進一步兩兩比較用LSD-t檢驗,P <0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結果

        2.1 各組小鼠甲狀腺組織形態(tài)變化

        正常組小鼠光鏡下甲狀腺濾泡呈橢圓形或者圓形,濾泡腔內充滿淡紅色膠質,同時內有適量吸收空泡;甲狀腺肉眼觀為細條狀、淡紅色。模型組小鼠光鏡下可見甲狀腺組織中有彌漫性或灶性淋巴細胞浸潤,并伴甲狀腺濾泡萎縮;甲狀腺濾泡上皮較正常略大,濾泡腔變小;甲狀腺肉眼可見顏色變談,并且與周圍組織不粘連。實驗組小鼠病變程度較模型組明顯減輕。見圖1。

        圖1 各組小鼠甲狀腺病理形態(tài)學觀察 (HE染色×200)

        2.2 各組小鼠血清TGAb和TPOAb水平比較

        正常組、模型組和實驗組小鼠血清TGAb 和TPOAb 水平比較,經單因素方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05)。進一步兩兩比較結果顯示:正常組低于實驗組和模型組(P <0.05);實驗組低于模型組(P <0.05)。見表1。

        表1 各組小鼠血清TGAb和TPOAb水平比較(n=20,mIU/L,±s)

        表1 各組小鼠血清TGAb和TPOAb水平比較(n=20,mIU/L,±s)

        注:①與正常組比較,P <0.05;②與模型組比較,P <0.05。

        組別TPOAb TGAb正常組模型組實驗組F 值P 值1.38±0.25 2.87±0.56①1.83±0.31①②4.983 0.019 108.32±28.39 297.21±38.41①147.54±23.15①②39.479 0.000

        2.3 各組小鼠淋巴細胞浸潤程度比較

        正常組、模型組和實驗組小鼠淋巴細胞浸潤程度分別為(0.28±0.05) 分、(3.97±0.78) 分和(1.83±0.41)分,經單因素方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(F=6.521,P=0.002)。進一步兩兩比較結果顯示:正常組低于實驗組和模型組(P <0.05);實驗組低于模型組(P <0.05)。

        2.4 各組小鼠外周血T淋巴細胞亞群變化

        正常組、模型組和實驗組小鼠CD3+CD4+和CD3+CD8+比較,經單因素方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05)。進一步兩兩比較結果顯示:正常組低于實驗組和模型組(P <0.05);實驗組低于模型組(P <0.05)。見表2。

        表2 各組小鼠外周血T淋巴細胞亞群比較(n=20,%,±s)

        表2 各組小鼠外周血T淋巴細胞亞群比較(n=20,%,±s)

        注:①與正常組比較,P <0.05;②與模型組比較,P <0.05。

        組別CD3+CD8+CD3+CD4+正常組模型組實驗組F 值P 值0.45±0.12 10.37±1.78①3.15±0.79①②16.573 0.000 2.16±0.39 15.87±2.97①8.39±1.86①②28.192 0.000

        3 討論

        AT 主要包括特發(fā)性粘液性水腫、Hashimoto's甲狀腺炎及Grave's 病等,其中Hashimoto's 甲狀腺炎即慢性淋巴細胞性甲狀腺炎[7-14]。AT 主要是由于機體對甲狀腺產生了體液免疫和細胞免疫反應,造成甲狀腺功能紊亂[15-20]。目前,臨床上針對AT 患者主要采用西醫(yī)治療,但其效果并不十分理想,且會導致患者免疫功能下降。近年來,隨著中醫(yī)藥的不斷深入研究,其應用于AT 患者獲得良好療效,且可增強機體免疫功能[20]。

        大黃素屬一種蒽醌類衍生物,具有清熱解毒功效。藥理研究表明,大黃素具有抑制胰酶活性、免疫調節(jié)、抗氧化、改善微循環(huán)、保護肝腎、抑菌、抗炎及清除自由基等作用。研究報道顯示,大黃素主要經調節(jié)T 淋巴細胞亞群間的分化、平衡及其分泌能力,進一步發(fā)揮免疫保護作用[21]。本研究結果發(fā)現(xiàn),與模型組比較,實驗組淋巴細胞浸潤程度減輕,由此可見大黃素可減輕甲狀腺組織淋巴細胞浸潤程度。TGAb 和TPOAb 是AT 的特征性自身抗體,通常AT 患者表現(xiàn)為血清TGAb和TPOAb 水平升高,并且兩者在患者血清中表達是臨床診斷AT 的重要指標。本研究結果發(fā)現(xiàn),與模型組相比,實驗組血清TGAb 和TPOAb 水平降低,由此可見大黃素可降低血清TGAb 和TPOAb水平。

        CD4+與CD8+T 細胞是人體免疫系統(tǒng)中重要的免疫細胞,其中CD4+主要表達于輔助T 細胞,并且是Th 細胞TCR 識別抗原的共受體,同時與MHC Ⅱ類分子的非多肽區(qū)結合,從而參與Th 細胞TCR 識別抗原的信號轉導[22-23];其中CD8+主要表達于細胞毒性T 細胞上,并且通過表面的MHC Ⅰ類分子與CD4 等其他免疫細胞的MHC Ⅱ類分子結合,識別其他免疫細胞表面結合的抗原物質[24-25]。本研究結果發(fā)現(xiàn),與模型組相比,實驗組CD3+、CD4+和CD4+CD8+水平下降,由此可見大黃素可調節(jié)免疫平衡。

        綜上所述,大黃素可下調AT 小鼠血清TGAb和TPOAb,減輕淋巴細胞浸潤程度,調節(jié)小鼠免疫功能。

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