張國平，李攀，胡通海，吳可人

（1.嵊州市中醫(yī)院 外二科，浙江 嵊州312400；2.浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院肝膽外科，浙江 杭州310000）

自身免疫性甲狀腺炎（autoimmune thyroiditis,AT）主要是由免疫功能紊亂、環(huán)境及遺傳等因素綜合作用導致的自身免疫性疾病，是細胞免疫與體液免疫共同作用的結果[1-3]。AT 發(fā)病率不斷上升，嚴重影響人們生活質量[4-5]。近年來，臨床上針對AT 主要采用免疫抑制劑、糖皮質激素等治療，但其效果并不十分理想，且對機體免疫功能造成較大損害[6]。而大黃素屬一種蒽醌類衍生物，具有一定的免疫抑制作用。因此，本文研究旨在探討大黃素治療AT 小鼠的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60 只SPF 級昆明小鼠，雌性，適應性飼養(yǎng)1 周，濕度（55±10）%，溫度（23±2）℃，自由飲食，購自遼寧實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK2017-0001，動物使用許可證號：SCXK2017-0008。

1.2 主要試劑和儀器

大黃素（南京景竹生物科技有限公司，純度98%），小鼠甲狀腺球蛋白抗體（thyroglobulin antibody, TGAb） 和甲狀腺過氧化物酶自身抗體（thyroid peroxidase autoantibody, TPOAb）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司）。Bio-Rad酶標儀（美國伯樂公司），流式細胞儀（美國BD公司）。

1.3 動物模型的復制與分組

1.3.1 模型復制取10 mg 豬甲狀腺球蛋白溶于5 ml 水，將其與完全弗氏佐劑等體積充分混合制成油包水乳劑。取小鼠甲狀腺球蛋白0.5 ml，均勻分布于腹部、背部2 點皮下注射，初次免疫為每個點注射0.25 ml，14 d 后取甲狀腺球蛋白與不完全弗氏佐劑等體積混合，再多點皮下注射，持續(xù)4 周。

1.3.2 分組60 只小鼠隨機分為正常組、模型組和實驗組，每組20 只。實驗組給予75 mg/kg 大黃素灌胃，1 次/d，持續(xù)8 周；對照組和模型組灌胃等劑量生理鹽水，1 次/d，持續(xù)8 周。

1.4 方法

1.4.1 甲狀腺組織形態(tài)觀察取小鼠甲狀腺組織，以生理鹽水清洗，在10%中性甲醛溶液中固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，行常規(guī)HE 染色，在顯微鏡下觀察淋巴細胞浸潤情況。

1.4.2 血清TGAb 和TPOAb 水平檢測各組小鼠摘眼球取血0.3 ml，靜置15 min，2 500 r/min 離心12 min，離心半徑15 cm，取上清液，采用ELISA測定TGAb 和TPOAb 水平，嚴格依據(jù)試劑盒說明書進行操作。

1.4.3 甲狀腺淋巴細胞浸潤程度評價甲狀腺淋巴浸潤程度=濾泡間浸潤程度+上皮間淋巴浸潤程度。濾泡間浸潤程度評價：（-）為0 分；（±）為1 分；（+）為2 分；（++）為3 分；（+++）為4 分。上皮間浸潤程度：0 個炎細胞/張切片為0 分；1 或2 個炎癥細胞/張切片為1 分；1 個炎細胞/10 個高倍視野為2 分；1 個炎細胞/5 高倍視野為3 分；1 個炎細胞/2 高倍視野為4 分。

1.4.4 外周血T淋巴細胞亞群檢測各組小鼠摘眼球取血0.3 ml，肝素抗凝，制備成1×107個/ml 單細胞懸液，加入抗體，避光染色30 min，加入溶血素反應10 min，2 500 r/min離心6 min，離心半徑15 cm，棄上清液，加入PBS 溶液洗滌2 次，加入1%多聚甲醛固定，采用流式細胞術測定T 淋巴細胞亞群變化。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠甲狀腺組織形態(tài)變化

正常組小鼠光鏡下甲狀腺濾泡呈橢圓形或者圓形，濾泡腔內充滿淡紅色膠質，同時內有適量吸收空泡；甲狀腺肉眼觀為細條狀、淡紅色。模型組小鼠光鏡下可見甲狀腺組織中有彌漫性或灶性淋巴細胞浸潤，并伴甲狀腺濾泡萎縮；甲狀腺濾泡上皮較正常略大，濾泡腔變小；甲狀腺肉眼可見顏色變談，并且與周圍組織不粘連。實驗組小鼠病變程度較模型組明顯減輕。見圖1。

圖1 各組小鼠甲狀腺病理形態(tài)學觀察 （HE染色×200）

2.2 各組小鼠血清TGAb和TPOAb水平比較

正常組、模型組和實驗組小鼠血清TGAb 和TPOAb 水平比較，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。進一步兩兩比較結果顯示：正常組低于實驗組和模型組（P ＜0.05）；實驗組低于模型組（P ＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠血清TGAb和TPOAb水平比較（n=20，mIU/L，±s）

表1 各組小鼠血清TGAb和TPOAb水平比較（n=20，mIU/L，±s）

注：①與正常組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

組別TPOAb TGAb正常組模型組實驗組F 值P 值1.38±0.25 2.87±0.56①1.83±0.31①②4.983 0.019 108.32±28.39 297.21±38.41①147.54±23.15①②39.479 0.000

2.3 各組小鼠淋巴細胞浸潤程度比較

正常組、模型組和實驗組小鼠淋巴細胞浸潤程度分別為（0.28±0.05） 分、（3.97±0.78） 分和（1.83±0.41）分，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=6.521，P=0.002）。進一步兩兩比較結果顯示：正常組低于實驗組和模型組（P ＜0.05）；實驗組低于模型組（P ＜0.05）。

2.4 各組小鼠外周血T淋巴細胞亞群變化

正常組、模型組和實驗組小鼠CD3+CD4+和CD3+CD8+比較，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。進一步兩兩比較結果顯示：正常組低于實驗組和模型組（P ＜0.05）；實驗組低于模型組（P ＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠外周血T淋巴細胞亞群比較（n=20，%，±s）

表2 各組小鼠外周血T淋巴細胞亞群比較（n=20，%，±s）

注：①與正常組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

組別CD3+CD8+CD3+CD4+正常組模型組實驗組F 值P 值0.45±0.12 10.37±1.78①3.15±0.79①②16.573 0.000 2.16±0.39 15.87±2.97①8.39±1.86①②28.192 0.000

3 討論

AT 主要包括特發(fā)性粘液性水腫、Hashimoto's甲狀腺炎及Grave's 病等，其中Hashimoto's 甲狀腺炎即慢性淋巴細胞性甲狀腺炎[7-14]。AT 主要是由于機體對甲狀腺產生了體液免疫和細胞免疫反應，造成甲狀腺功能紊亂[15-20]。目前，臨床上針對AT 患者主要采用西醫(yī)治療，但其效果并不十分理想，且會導致患者免疫功能下降。近年來，隨著中醫(yī)藥的不斷深入研究，其應用于AT 患者獲得良好療效，且可增強機體免疫功能[20]。

大黃素屬一種蒽醌類衍生物，具有清熱解毒功效。藥理研究表明，大黃素具有抑制胰酶活性、免疫調節(jié)、抗氧化、改善微循環(huán)、保護肝腎、抑菌、抗炎及清除自由基等作用。研究報道顯示，大黃素主要經調節(jié)T 淋巴細胞亞群間的分化、平衡及其分泌能力，進一步發(fā)揮免疫保護作用[21]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，實驗組淋巴細胞浸潤程度減輕，由此可見大黃素可減輕甲狀腺組織淋巴細胞浸潤程度。TGAb 和TPOAb 是AT 的特征性自身抗體，通常AT 患者表現(xiàn)為血清TGAb和TPOAb 水平升高，并且兩者在患者血清中表達是臨床診斷AT 的重要指標。本研究結果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，實驗組血清TGAb 和TPOAb 水平降低，由此可見大黃素可降低血清TGAb 和TPOAb水平。

CD4+與CD8+T 細胞是人體免疫系統(tǒng)中重要的免疫細胞，其中CD4+主要表達于輔助T 細胞，并且是Th 細胞TCR 識別抗原的共受體，同時與MHC Ⅱ類分子的非多肽區(qū)結合，從而參與Th 細胞TCR 識別抗原的信號轉導[22-23]；其中CD8+主要表達于細胞毒性T 細胞上，并且通過表面的MHC Ⅰ類分子與CD4 等其他免疫細胞的MHC Ⅱ類分子結合，識別其他免疫細胞表面結合的抗原物質[24-25]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，實驗組CD3+、CD4+和CD4+CD8+水平下降，由此可見大黃素可調節(jié)免疫平衡。

綜上所述，大黃素可下調AT 小鼠血清TGAb和TPOAb，減輕淋巴細胞浸潤程度，調節(jié)小鼠免疫功能。