孟新宇，劉娟，畢京玉，尚念秀

（山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬濟(jì)南市人民醫(yī)院1.耳鼻喉科，2.皮膚科，山東 濟(jì)南271199）

鼻咽癌是頭頸部最常見(jiàn)的腫瘤之一，我國(guó)2013年鼻咽癌發(fā)病和死亡比例分別為3.09/100 000和1.57/100 000，成為重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。越來(lái)越多的研究證實(shí)，內(nèi)科化學(xué)藥物治療（以下簡(jiǎn)稱(chēng)化療）不再是一種姑息治療手段，而是鼻咽癌根治性治療的重要組成部分，同步放化療、輔助化療和誘導(dǎo)化療可提高鼻咽癌的治療效果[2]。然而化療藥物的耐藥嚴(yán)重影響了鼻咽癌預(yù)后，因此亟需尋找提高鼻咽癌化療敏感性的靶點(diǎn)。

Rsf-1 位于11q13.5 染色體上，是人類(lèi)核心組蛋白及染色質(zhì)組裝相關(guān)因子家族一員，與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、衰老和死亡等密切相關(guān)[3]。Rsf-1 在腎細(xì)胞癌[4]、乳腺癌[5]、前列腺癌[6]等腫瘤組織中高表達(dá)，并且與不良生存預(yù)后有關(guān)；另外，Rsf-1 還與化療藥物的耐藥性有關(guān)[7]。Rsf-1 在鼻咽癌組織中的表達(dá)及意義既往少有報(bào)道。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)鼻咽癌組織中Rsf-1 的表達(dá)水平，用ATP 生物熒光抗癌藥物敏感性檢測(cè)技術(shù)（ATP based bioluminescence tumor chemoesensitivity assay，ATP-TCA）檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞的體外化療藥物敏感性，探討Rsf-1 與鼻咽癌臨床病理特征、化療敏感性和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年3月—2017年8月山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬濟(jì)南市人民醫(yī)院收治的96 例鼻咽癌患者的癌組織標(biāo)本。其中，男性61 例，女性35 例；年齡21～78 歲，平均（47.98±10.23）歲；國(guó)際抗癌聯(lián)盟頭頸腫瘤臨床分期為Ⅰ期7 例、Ⅱ期15 例、Ⅲ期53 例、Ⅳ期21 例。此外，選取同期本院40 例鼻咽部慢性炎癥組織標(biāo)本作為對(duì)照，其中男性22 例，女性18 例；年齡18～68 歲，平均（47.36±10.32）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，所有患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑和儀器

兔抗人RSF-1 單克隆抗體和山羊抗兔IgG 購(gòu)自武漢菲恩生物科技有限公司，免疫組織化學(xué)SP 試劑盒、EDTA 修復(fù)液、DAB 顯色液購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，ATP-TCA 試劑盒夠自北京百奧萊博科技有限公司。氟尿嘧啶、順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、紫杉醇、多西他賽、吉西他濱、環(huán)磷酰胺購(gòu)自北京科展生物科技有限公司），以上化療藥的血漿峰值濃度（peak plasma concentration, PPC）分別為22.5 μg/ml、6.3μg/ml、25.0μg/ml、10.0μg/ml、13.8μg/ml、10.0μg/ml、3.0 μg/ml 和3.0 μg/ml。IX-70 型倒置光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司，F(xiàn)LUOstar OPTIMA 多功能熒光發(fā)光分析儀購(gòu)自德國(guó)BMG 公司。

1.3 免疫組織化學(xué)法及結(jié)果判定

組織石蠟標(biāo)本均由本院病理科完成，切片厚度為4 μm，在70℃下烤片30 min，隨后進(jìn)行脫蠟處理。用EDTA 修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，羊血清封閉30 min，加入兔抗人Rsf-1 單克隆抗體（1∶1 000稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶500 稀釋?zhuān)?7℃孵育30 min。隨后用辣根標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液和DAB 顯色液處理，蘇木精復(fù)染。經(jīng)過(guò)脫水、透明、封片處理后在顯微鏡下觀(guān)察。每張切片隨機(jī)取10 個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100 個(gè)細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞的染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞比例判斷Rsf-1 表達(dá)水平。

染色強(qiáng)度：染色陰性為0 分，染色為淺黃色為1 分，染色為棕黃色為2 分，染色為棕褐色為3 分。陽(yáng)性細(xì)胞比例：0%～25%計(jì)1 分，＞25%～50%計(jì)2 分，＞50%～75%計(jì)3 分，＞75%～100%計(jì)4 分。將2 個(gè)得分相乘得出最終結(jié)果，0～4 分為低表達(dá)；6～12 分為高表達(dá)[8]。

1.4 ATP-TCA藥敏檢測(cè)

嚴(yán)格按照ATP-TCA 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，取癌組織機(jī)械剪碎后加入組織消化酶，制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至4×104個(gè)/孔，接種于96 孔板。將化療藥物（氟尿嘧啶、順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、紫杉醇、多西他賽、吉西他濱、環(huán)磷酰胺）進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)O(shè)置5 個(gè)藥物測(cè)試濃度，分別為12.5% PPC、25.0% PPC、50.0% PPC、100.0% PPC和200.0% PPC，另外設(shè)置不加藥陰性對(duì)照組（MO）、加入最大ATP 抑制劑組（M1）。在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)5 d，加入50 μl ATP 提取液，混勻后取混合液50 μl 置于微孔板，加入50 μl 發(fā)光液。用微板熒光分析儀分析每孔在560 nm 波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度。腫瘤生長(zhǎng)抑制率=[1-（test-M1）]/（M0-M1）]×100%，用熒光測(cè)定儀自帶分析軟件計(jì)算各測(cè)試濃度的腫瘤生長(zhǎng)抑制率及各藥物的IC50和IC90。參考劉新福等[9]的研究判斷藥物敏感性，高度敏感：IC50≤25% PPC 及IC90≤100% PPC；中度敏感：IC50≤25% PPC 及IC90＞100% PPC；低度敏感：IC50＞25% PPC 及IC90≤100% PPC；耐藥：IC50＞25%PPC 及IC90＞100%PPC。

1.5 隨訪(fǎng)

術(shù)后以電話(huà)和門(mén)診方式對(duì)鼻咽癌患者進(jìn)行隨訪(fǎng)，術(shù)后1年內(nèi)每3 個(gè)月隨訪(fǎng)1 次，隨后每6 個(gè)月隨訪(fǎng)1 次。隨訪(fǎng)時(shí)間截至2018年12月。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；不同濃度化療藥物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)抑制率影響的比較用2×2 析因設(shè)計(jì)方差分析；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)。影響患者預(yù)后的因素采用單因素、多因素Cox 回歸分析。生存分析用Kaplan-Meier 曲線(xiàn)和Log-rank χ2檢驗(yàn)，所有檢驗(yàn)為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Rsf-1在鼻咽癌組織中的表達(dá)

Rsf-1在鼻咽癌組織中主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，部分表達(dá)于細(xì)胞核，呈棕色，在炎癥組織中幾乎不表達(dá)（見(jiàn)圖1）。鼻咽癌組織與慢性炎癥組織Rsf-1 高表達(dá)率分別為66.67%（64/96）和7.50%（3/40），經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=39.546，P=0.000），鼻咽癌組織高于慢性炎癥組織。

圖1 鼻咽癌和慢性炎癥組織中Rsf-1的表達(dá) （免疫組織化學(xué)法）

2.2 Rsf-1 表達(dá)水平與鼻咽癌患者臨床病理特征的關(guān)系

T3期、T4期患者與T1期、T2期患者的Rsf-1 高表達(dá)率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），T3期、T4期患者高表達(dá)率高于T1期、T2期患者。男性與女性，≥50歲與＜50歲，N2期、N3期與N0期、N1期，M1期與M0期，臨床分期Ⅰ期、Ⅱ期與Ⅲ期、Ⅳ期患者的Rsf-1高表達(dá)率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各臨床病理特征鼻咽癌患者的Rsf-1高表達(dá)率比較例（%）

2.3 藥敏檢測(cè)結(jié)果分析

不同濃度化療藥物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制率比較，經(jīng)2×2 析因設(shè)計(jì)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F交互=178.980，P交互=0.000；F濃度=98.704，P濃度=0.000；F藥物=9.783，P藥物=0.019）。隨著藥物濃度下降，腫瘤生長(zhǎng)抑制率逐漸降低，卡鉑在不同濃度下的腫瘤生長(zhǎng)抑制率均比其他藥物高，而多西他賽和吉西他濱相對(duì)較低。見(jiàn)表2。

表2 不同濃度化療藥物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)抑制率的影響 （%，±s）

表2 不同濃度化療藥物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)抑制率的影響 （%，±s）

濃度氟尿嘧啶順鉑卡鉑奧沙利鉑紫杉醇多西他賽吉西他濱環(huán)磷酰胺12.5%PPC 25.0%PPC 50.0%PPC 100.0%PPC 200.0%PPC 26.23±6.45 39.78±8.01 46.65±7.23 54.09±8.90 62.12±10.01 25.09±5.54 41.36±9.09 47.02±7.34 55.90±11.11 63.01±9.78 36.16±11.11 48.59±8.67 54.08±10.72 60.09±9.78 65.09±10.01 21.22±3.43 37.76±5.29 46.38±6.66 52.09±8.76 59.88±12.21 23.82±4.03 36.18±6.13 46.32±9.34 53.00±10.12 59.01±8.78 16.62±4.02 22.37±3.53 35.27±8.03 40.71±7.77 44.56±8.56 15.03±2.09 21.21±4.06 34.72±5.24 41.39±4.18 46.70±10.00 19.28±4.32 29.04±8.01 40.33±5.93 46.01±8.77 50.32±11.12

不同化療藥物的耐藥率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=43.091，P=0.001），多西他賽和吉西他濱的耐藥率均高于氟尿嘧啶、順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、紫杉醇、環(huán)磷酰胺（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 ATP-TCA藥敏試驗(yàn)結(jié)果 例（%）

2.4 Rsf-1表達(dá)水平與化療藥物耐藥性的關(guān)系

Rsf-1 高表達(dá)組與低表達(dá)組的紫杉醇耐藥率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.545，P=0.019），高表達(dá)組高于低表達(dá)組。其余化療藥耐藥率組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

表4 不同Rsf-1表達(dá)水平患者的化療藥物耐藥性比較例（%）

2.5 鼻咽癌患者預(yù)后的影響因素分析

表5 鼻咽癌患者預(yù)后的單因素Cox回歸分析參數(shù)

2.6 Rsf-1表達(dá)水平與鼻咽癌患者預(yù)后的關(guān)系

96 例患者隨訪(fǎng)時(shí)間8～45 個(gè)月，中位隨訪(fǎng)時(shí)間24 個(gè)月。Rsf-1 高表達(dá)組和低表達(dá)組的總體生存時(shí)間比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.998，P=0.037），高表達(dá)組低于低表達(dá)組。見(jiàn)圖2。

表6 鼻咽癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析參數(shù)

圖2 不同Rsf-1表達(dá)水平鼻咽癌患者的生存曲線(xiàn)

3 討論

鼻咽癌的惡性程度較高，早期容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移?；熢诒茄拾┚C合治療中起到重要作用，而化療藥物耐藥是導(dǎo)致治療失敗的主要原因之一，因此尋找早期評(píng)價(jià)鼻咽癌化療敏感性和預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)具有重要意義。本研究結(jié)果顯示，Rsf-1與紫杉醇耐藥及患者生存預(yù)后有關(guān)。

Rsf-1 又被稱(chēng)為肝炎BX-抗原相關(guān)蛋白，對(duì)乙肝病毒復(fù)制周期的調(diào)控有重要作用[10]。越來(lái)越多的研究顯示，Rsf-1 與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、分化、細(xì)胞周期調(diào)控及異常染色體修復(fù)等密切相關(guān)[5,11]。本研究結(jié)果表明，與慢性炎癥組織相比，鼻咽癌組織Rsf-1 高表達(dá)較高，另外鼻咽癌Rsf-1高表達(dá)組患者T3期、T4期占比和Ⅲ期、Ⅳ期占比高于低表達(dá)組，提示Rsf-1 可能參與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展。

本研究對(duì)96 例鼻咽癌組織進(jìn)行ATP-TCA 藥敏檢測(cè)，結(jié)果顯示鼻咽癌細(xì)胞對(duì)8 種化療藥（氟尿嘧啶、順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、紫杉醇、多西他賽、吉西他濱、環(huán)磷酰胺） 的耐藥率為8.33%～48.96%，其中卡鉑的耐藥率最低，多西他賽的耐藥率最高。紫杉醇是鼻咽癌化療中最常用的藥物，本研究結(jié)果表明，Rsf-1 高表達(dá)組的紫杉醇耐藥率高于低表達(dá)組。在宮頸癌、卵巢癌和非小細(xì)胞肺癌的研究中，Rsf-1 高表達(dá)也與紫杉醇耐藥有關(guān)[12-14]。Rsf-1 參與紫杉醇耐藥的機(jī)制可能與其調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子-κB 信號(hào)通路[13]、Ras-絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路[15]有關(guān)，另外Rsf-1 與人類(lèi)蔗糖非發(fā)酵蛋白2 同源物形成的蛋白復(fù)合物也發(fā)揮了耐藥作用[14]。

鼻咽癌M 分期、臨床分期是鼻咽癌患者生存預(yù)后的影響因素，與既往報(bào)道結(jié)果一致[16-17]。本研究結(jié)果表明，Rsf-1 與鼻咽癌患者預(yù)后有關(guān)；Rsf-1表達(dá)水平越高，生存時(shí)間越短。既往研究也發(fā)現(xiàn)，Rsf-1 高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌、宮頸癌和肝癌等的不良生存預(yù)后有關(guān)[18]。Rsf-1 可能會(huì)成為鼻咽癌預(yù)后的標(biāo)志物。

本研究的局限性為：①未分析Rsf-1 在鼻咽癌中作用的分子生物學(xué)機(jī)制；②未檢測(cè)血清中Rsf-1的表達(dá)，Rsf-1 在鼻咽癌早期診斷中的價(jià)值需要進(jìn)一步分析；③本研究對(duì)鼻咽癌的耐藥性進(jìn)行了體外研究，未分析本組患者Rsf-1 表達(dá)水平與化療效果及藥敏的關(guān)系，這是因?yàn)楸狙芯课茨車(chē)?yán)格控制治療方案，未來(lái)需要設(shè)計(jì)臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。

綜上所述，Rsf-1 在鼻咽癌組織中高表達(dá)，并且與紫杉醇耐藥及患者不良生存預(yù)后有關(guān)。