孟新宇，劉娟，畢京玉，尚念秀

（山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬濟南市人民醫(yī)院1.耳鼻喉科，2.皮膚科，山東 濟南271199）

鼻咽癌是頭頸部最常見的腫瘤之一，我國2013年鼻咽癌發(fā)病和死亡比例分別為3.09/100 000和1.57/100 000，成為重要的公共衛(wèi)生問題[1]。越來越多的研究證實，內(nèi)科化學(xué)藥物治療（以下簡稱化療）不再是一種姑息治療手段，而是鼻咽癌根治性治療的重要組成部分，同步放化療、輔助化療和誘導(dǎo)化療可提高鼻咽癌的治療效果[2]。然而化療藥物的耐藥嚴重影響了鼻咽癌預(yù)后，因此亟需尋找提高鼻咽癌化療敏感性的靶點。

Rsf-1 位于11q13.5 染色體上，是人類核心組蛋白及染色質(zhì)組裝相關(guān)因子家族一員，與細胞凋亡、細胞周期、衰老和死亡等密切相關(guān)[3]。Rsf-1 在腎細胞癌[4]、乳腺癌[5]、前列腺癌[6]等腫瘤組織中高表達，并且與不良生存預(yù)后有關(guān)；另外，Rsf-1 還與化療藥物的耐藥性有關(guān)[7]。Rsf-1 在鼻咽癌組織中的表達及意義既往少有報道。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測鼻咽癌組織中Rsf-1 的表達水平，用ATP 生物熒光抗癌藥物敏感性檢測技術(shù)（ATP based bioluminescence tumor chemoesensitivity assay，ATP-TCA）檢測鼻咽癌細胞的體外化療藥物敏感性，探討Rsf-1 與鼻咽癌臨床病理特征、化療敏感性和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年3月—2017年8月山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬濟南市人民醫(yī)院收治的96 例鼻咽癌患者的癌組織標本。其中，男性61 例，女性35 例；年齡21～78 歲，平均（47.98±10.23）歲；國際抗癌聯(lián)盟頭頸腫瘤臨床分期為Ⅰ期7 例、Ⅱ期15 例、Ⅲ期53 例、Ⅳ期21 例。此外，選取同期本院40 例鼻咽部慢性炎癥組織標本作為對照，其中男性22 例，女性18 例；年齡18～68 歲，平均（47.36±10.32）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，所有患者簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

兔抗人RSF-1 單克隆抗體和山羊抗兔IgG 購自武漢菲恩生物科技有限公司，免疫組織化學(xué)SP 試劑盒、EDTA 修復(fù)液、DAB 顯色液購自美國Sigma 公司，ATP-TCA 試劑盒夠自北京百奧萊博科技有限公司。氟尿嘧啶、順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、紫杉醇、多西他賽、吉西他濱、環(huán)磷酰胺購自北京科展生物科技有限公司），以上化療藥的血漿峰值濃度（peak plasma concentration, PPC）分別為22.5 μg/ml、6.3μg/ml、25.0μg/ml、10.0μg/ml、13.8μg/ml、10.0μg/ml、3.0 μg/ml 和3.0 μg/ml。IX-70 型倒置光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus 公司，F(xiàn)LUOstar OPTIMA 多功能熒光發(fā)光分析儀購自德國BMG 公司。

1.3 免疫組織化學(xué)法及結(jié)果判定

組織石蠟標本均由本院病理科完成，切片厚度為4 μm，在70℃下烤片30 min，隨后進行脫蠟處理。用EDTA 修復(fù)液進行抗原修復(fù)，羊血清封閉30 min，加入兔抗人Rsf-1 單克隆抗體（1∶1 000稀釋），4℃過夜，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（1∶500 稀釋），37℃孵育30 min。隨后用辣根標記的鏈霉素卵白素工作液和DAB 顯色液處理，蘇木精復(fù)染。經(jīng)過脫水、透明、封片處理后在顯微鏡下觀察。每張切片隨機取10 個視野，每個視野計數(shù)100 個細胞，根據(jù)細胞的染色強度及陽性細胞比例判斷Rsf-1 表達水平。

染色強度：染色陰性為0 分，染色為淺黃色為1 分，染色為棕黃色為2 分，染色為棕褐色為3 分。陽性細胞比例：0%～25%計1 分，＞25%～50%計2 分，＞50%～75%計3 分，＞75%～100%計4 分。將2 個得分相乘得出最終結(jié)果，0～4 分為低表達；6～12 分為高表達[8]。

1.4 ATP-TCA藥敏檢測

嚴格按照ATP-TCA 試劑盒說明書進行操作，取癌組織機械剪碎后加入組織消化酶，制備單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度至4×104個/孔，接種于96 孔板。將化療藥物（氟尿嘧啶、順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、紫杉醇、多西他賽、吉西他濱、環(huán)磷酰胺）進行梯度稀釋，設(shè)置5 個藥物測試濃度，分別為12.5% PPC、25.0% PPC、50.0% PPC、100.0% PPC和200.0% PPC，另外設(shè)置不加藥陰性對照組（MO）、加入最大ATP 抑制劑組（M1）。在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)5 d，加入50 μl ATP 提取液，混勻后取混合液50 μl 置于微孔板，加入50 μl 發(fā)光液。用微板熒光分析儀分析每孔在560 nm 波長處的熒光強度。腫瘤生長抑制率=[1-（test-M1）]/（M0-M1）]×100%，用熒光測定儀自帶分析軟件計算各測試濃度的腫瘤生長抑制率及各藥物的IC50和IC90。參考劉新福等[9]的研究判斷藥物敏感性，高度敏感：IC50≤25% PPC 及IC90≤100% PPC；中度敏感：IC50≤25% PPC 及IC90＞100% PPC；低度敏感：IC50＞25% PPC 及IC90≤100% PPC；耐藥：IC50＞25%PPC 及IC90＞100%PPC。

1.5 隨訪

術(shù)后以電話和門診方式對鼻咽癌患者進行隨訪，術(shù)后1年內(nèi)每3 個月隨訪1 次，隨后每6 個月隨訪1 次。隨訪時間截至2018年12月。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗；不同濃度化療藥物對腫瘤生長抑制率影響的比較用2×2 析因設(shè)計方差分析；計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗。影響患者預(yù)后的因素采用單因素、多因素Cox 回歸分析。生存分析用Kaplan-Meier 曲線和Log-rank χ2檢驗，所有檢驗為雙側(cè)檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Rsf-1在鼻咽癌組織中的表達

Rsf-1在鼻咽癌組織中主要表達于細胞質(zhì)，部分表達于細胞核，呈棕色，在炎癥組織中幾乎不表達（見圖1）。鼻咽癌組織與慢性炎癥組織Rsf-1 高表達率分別為66.67%（64/96）和7.50%（3/40），經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=39.546，P=0.000），鼻咽癌組織高于慢性炎癥組織。

圖1 鼻咽癌和慢性炎癥組織中Rsf-1的表達 （免疫組織化學(xué)法）

2.2 Rsf-1 表達水平與鼻咽癌患者臨床病理特征的關(guān)系

T3期、T4期患者與T1期、T2期患者的Rsf-1 高表達率比較，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），T3期、T4期患者高表達率高于T1期、T2期患者。男性與女性，≥50歲與＜50歲，N2期、N3期與N0期、N1期，M1期與M0期，臨床分期Ⅰ期、Ⅱ期與Ⅲ期、Ⅳ期患者的Rsf-1高表達率比較，經(jīng)χ2檢驗，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各臨床病理特征鼻咽癌患者的Rsf-1高表達率比較例（%）

2.3 藥敏檢測結(jié)果分析

不同濃度化療藥物對腫瘤生長的抑制率比較，經(jīng)2×2 析因設(shè)計方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F交互=178.980，P交互=0.000；F濃度=98.704，P濃度=0.000；F藥物=9.783，P藥物=0.019）。隨著藥物濃度下降，腫瘤生長抑制率逐漸降低，卡鉑在不同濃度下的腫瘤生長抑制率均比其他藥物高，而多西他賽和吉西他濱相對較低。見表2。

表2 不同濃度化療藥物對腫瘤生長抑制率的影響 （%，±s）

表2 不同濃度化療藥物對腫瘤生長抑制率的影響 （%，±s）

濃度氟尿嘧啶順鉑卡鉑奧沙利鉑紫杉醇多西他賽吉西他濱環(huán)磷酰胺12.5%PPC 25.0%PPC 50.0%PPC 100.0%PPC 200.0%PPC 26.23±6.45 39.78±8.01 46.65±7.23 54.09±8.90 62.12±10.01 25.09±5.54 41.36±9.09 47.02±7.34 55.90±11.11 63.01±9.78 36.16±11.11 48.59±8.67 54.08±10.72 60.09±9.78 65.09±10.01 21.22±3.43 37.76±5.29 46.38±6.66 52.09±8.76 59.88±12.21 23.82±4.03 36.18±6.13 46.32±9.34 53.00±10.12 59.01±8.78 16.62±4.02 22.37±3.53 35.27±8.03 40.71±7.77 44.56±8.56 15.03±2.09 21.21±4.06 34.72±5.24 41.39±4.18 46.70±10.00 19.28±4.32 29.04±8.01 40.33±5.93 46.01±8.77 50.32±11.12

不同化療藥物的耐藥率比較，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=43.091，P=0.001），多西他賽和吉西他濱的耐藥率均高于氟尿嘧啶、順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、紫杉醇、環(huán)磷酰胺（P＜0.05）。見表3。

表3 ATP-TCA藥敏試驗結(jié)果 例（%）

2.4 Rsf-1表達水平與化療藥物耐藥性的關(guān)系

Rsf-1 高表達組與低表達組的紫杉醇耐藥率比較，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.545，P=0.019），高表達組高于低表達組。其余化療藥耐藥率組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 不同Rsf-1表達水平患者的化療藥物耐藥性比較例（%）

2.5 鼻咽癌患者預(yù)后的影響因素分析

表5 鼻咽癌患者預(yù)后的單因素Cox回歸分析參數(shù)

2.6 Rsf-1表達水平與鼻咽癌患者預(yù)后的關(guān)系

96 例患者隨訪時間8～45 個月，中位隨訪時間24 個月。Rsf-1 高表達組和低表達組的總體生存時間比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.998，P=0.037），高表達組低于低表達組。見圖2。

表6 鼻咽癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析參數(shù)

圖2 不同Rsf-1表達水平鼻咽癌患者的生存曲線

3 討論

鼻咽癌的惡性程度較高，早期容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移?；熢诒茄拾┚C合治療中起到重要作用，而化療藥物耐藥是導(dǎo)致治療失敗的主要原因之一，因此尋找早期評價鼻咽癌化療敏感性和預(yù)后的生物學(xué)指標具有重要意義。本研究結(jié)果顯示，Rsf-1與紫杉醇耐藥及患者生存預(yù)后有關(guān)。

Rsf-1 又被稱為肝炎BX-抗原相關(guān)蛋白，對乙肝病毒復(fù)制周期的調(diào)控有重要作用[10]。越來越多的研究顯示，Rsf-1 與腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲、分化、細胞周期調(diào)控及異常染色體修復(fù)等密切相關(guān)[5,11]。本研究結(jié)果表明，與慢性炎癥組織相比，鼻咽癌組織Rsf-1 高表達較高，另外鼻咽癌Rsf-1高表達組患者T3期、T4期占比和Ⅲ期、Ⅳ期占比高于低表達組，提示Rsf-1 可能參與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展。

本研究對96 例鼻咽癌組織進行ATP-TCA 藥敏檢測，結(jié)果顯示鼻咽癌細胞對8 種化療藥（氟尿嘧啶、順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、紫杉醇、多西他賽、吉西他濱、環(huán)磷酰胺） 的耐藥率為8.33%～48.96%，其中卡鉑的耐藥率最低，多西他賽的耐藥率最高。紫杉醇是鼻咽癌化療中最常用的藥物，本研究結(jié)果表明，Rsf-1 高表達組的紫杉醇耐藥率高于低表達組。在宮頸癌、卵巢癌和非小細胞肺癌的研究中，Rsf-1 高表達也與紫杉醇耐藥有關(guān)[12-14]。Rsf-1 參與紫杉醇耐藥的機制可能與其調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子-κB 信號通路[13]、Ras-絲裂原活化蛋白激酶信號通路[15]有關(guān)，另外Rsf-1 與人類蔗糖非發(fā)酵蛋白2 同源物形成的蛋白復(fù)合物也發(fā)揮了耐藥作用[14]。

鼻咽癌M 分期、臨床分期是鼻咽癌患者生存預(yù)后的影響因素，與既往報道結(jié)果一致[16-17]。本研究結(jié)果表明，Rsf-1 與鼻咽癌患者預(yù)后有關(guān)；Rsf-1表達水平越高，生存時間越短。既往研究也發(fā)現(xiàn)，Rsf-1 高表達與非小細胞肺癌、宮頸癌和肝癌等的不良生存預(yù)后有關(guān)[18]。Rsf-1 可能會成為鼻咽癌預(yù)后的標志物。

本研究的局限性為：①未分析Rsf-1 在鼻咽癌中作用的分子生物學(xué)機制；②未檢測血清中Rsf-1的表達，Rsf-1 在鼻咽癌早期診斷中的價值需要進一步分析；③本研究對鼻咽癌的耐藥性進行了體外研究，未分析本組患者Rsf-1 表達水平與化療效果及藥敏的關(guān)系，這是因為本研究未能嚴格控制治療方案，未來需要設(shè)計臨床實驗進行研究。

綜上所述，Rsf-1 在鼻咽癌組織中高表達，并且與紫杉醇耐藥及患者不良生存預(yù)后有關(guān)。