楊 聰，高建煒，馬學(xué)平，韓 坤，鄒 悅，張術(shù)斌，海 娥，陳麗莉

炭疽是由炭疽芽胞桿菌引起的自然疫源性傳染病。每年全球約有2萬～10萬起炭疽病例發(fā)生[1-2]，最新研究估算世界約有18.3億人生活在炭疽風(fēng)險區(qū)內(nèi)[3]。炭疽根據(jù)感染方式不同分為皮膚炭疽、肺炭疽和腸炭疽，最常見為皮膚炭疽，約占90%以上。近10年來全國每年報告的炭疽病例均在500例以下，疫情集中在青海、寧夏、內(nèi)蒙古、甘肅、云南、貴州等畜牧業(yè)發(fā)達地區(qū)[4]。2004-2017年，寧夏皮膚炭疽流行呈現(xiàn)較低水平的散發(fā)[5]。而2018年起寧夏報告皮膚炭疽感染病例顯著上升，且出現(xiàn)1例死亡病例[6]，為歷史罕見。本文將對2018-2019年寧夏皮膚炭疽疫情的流行病學(xué)資料及炭疽芽胞桿菌實驗室檢測情況進行分析討論，為寧夏皮膚炭疽疫情的預(yù)防和控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1描述性流行病學(xué)方法 收集寧夏2018-2019年通過網(wǎng)絡(luò)直報系統(tǒng)上報的炭疽病例信息，并對發(fā)病時間、發(fā)病地點和人群信息進行流行病學(xué)三間分布的分析。

1.2 菌株分離及鑒定

1.2.1試驗材料 炭疽桿菌核酸檢測(Real-time PCR法)試劑盒購自金瑞鴻捷生物有限公司；核酸提取試劑盒(QIAGEN DNA Mini kit)購自德國QIAGEN公司，血瓊脂平皿和普通營養(yǎng)瓊脂購自廣東環(huán)凱微生物有限公司，青霉素紙片購自英國OXOID公司，炭疽芽胞桿菌噬菌體由蘭州生物制品研究所提供，ABI7500fast熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2.2樣本處理 無菌棉拭子蘸取疑似患者皮膚病灶滲出液，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和血平皿，涂抹棉簽存放于200 μL無菌水的離心管中備用。

1.2.3細菌學(xué)檢測 按照《炭疽診斷標準》(WS283-2008)的方法進行炭疽細菌分離培養(yǎng)。判定標準為炭疽芽胞桿菌噬菌體裂解試驗及青霉素敏感試驗陽性可確定分離到炭疽芽胞桿菌。并結(jié)合流行病學(xué)數(shù)據(jù)比較采樣前后使用抗生素對炭疽芽胞桿菌分離率的影響。

1.3Real-time PCR 試劑盒以炭疽芽胞桿菌毒素質(zhì)粒PX01上的pagA和PX02上的capB基因，染色體原噬菌體λBa03上的PL3基因為靶基因。按照試劑盒說明書的要求，處理樣本并提取核酸后上機檢測。反應(yīng)體系為 20 μL，反應(yīng)條件為：93 ℃預(yù)變性15 s；93 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min，此步收集熒光信號，共40個循環(huán)。判定標準：首先試劑盒中的陰性對照和陽性對照成立，同時待檢樣品出現(xiàn)S型擴增且Ct值≤35時可判定結(jié)果為陽性。

2 結(jié) 果

2.1流行病學(xué)分析結(jié)果 2018-2019年，自治區(qū)炭疽檢測實驗室共接收到70個疑似皮膚炭疽感染病例的標本，根據(jù)《炭疽診斷標準》(WS283-2008)和《寧夏炭疽疫情處置技術(shù)方案》，結(jié)合疑似病例的流行病學(xué)接觸史、實驗室檢測結(jié)果及臨床癥狀，最終上報確定45例感染病例，上報病例包括確診病例12例，臨床診斷病例33例。(臨床診斷病例是在現(xiàn)有國家標準的基礎(chǔ)上結(jié)合寧夏工作實際情況，對有流行病學(xué)接觸史、典型臨床表現(xiàn)，皮膚滲出液Real-time PCR檢測陽性者，判斷為臨床診斷病例。)

2.1.1時間分布 2018-2019年上報皮膚炭疽感染病例45例，其中2018年上報27例，2019年上報18例。全年除1月、2月、3月和12月份之外，其它各月均有病例報告，從4月開始呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，8月達到高峰期，占病例總數(shù)的57.78%，9月開始下降(見圖1)，存在明顯的季節(jié)性。

圖1 2018-2019年寧夏皮膚炭疽時間分布情況Fig.1 Monthly incidence of human anthrax in Ningxia from 2018 to 2019

2.1.2地區(qū)分布 寧夏共有5個市，22個縣區(qū)。2018-2019年寧夏皮膚炭疽病例分布在11個縣區(qū)(占50.00%)，病例數(shù)由高至低分別為：西夏區(qū)10例、永寧縣8例、賀蘭縣8例、利通區(qū)5例、海原縣5例、原州區(qū)3例、靈武2例、金鳳區(qū)1例、興慶區(qū)1例、彭陽縣1例、同心縣1例(見圖2)。發(fā)病地區(qū)涉及養(yǎng)殖業(yè)、屠宰、自家飼養(yǎng)等農(nóng)村及城市邊緣等。相比2018年，2019年又新增了原州區(qū)、興慶區(qū)、彭陽縣3個縣區(qū)。

圖2 2018-2019年寧夏皮膚炭疽地區(qū)分布情況Fig.2 Regional distribution of the incidence of anthrax in Ningxia from 2018 to 2019

2.1.3人群分布 全區(qū)皮膚炭疽病例報告男性41例，女性4例，男女性別比約為10∶1。年齡最小16歲，最大75歲，30～60歲青壯年有31人，占病例總數(shù)的68.89%；職業(yè)以農(nóng)民為主，占病例總數(shù)的58%，其次為家畜屠宰者(見圖3)。發(fā)病患者均因直接或間接接觸病死家畜時未采取任何防護措施而被感染。

2.2 細菌學(xué)檢測結(jié)果

2.2.1菌株分離鑒定結(jié)果 2018-2019年共收集疑似皮膚炭疽感染標本70份。經(jīng)培養(yǎng)鑒定，共檢出12株炭疽芽胞桿菌，總檢出率為17.14%(見表1)。陽性樣本的滲出液培養(yǎng)物在血平板中呈現(xiàn)灰白色、扁平、不溶血、干燥且邊緣不整齊的粗糙型大菌落，在低倍鏡下菌落呈典型的獅鬃樣卷發(fā)狀，經(jīng)革蘭染色后可見呈竹節(jié)狀排列且兩端平齊的革蘭陽性大桿菌，有明顯的青霉素抑菌圈和噬菌裂解帶(見圖4)。

圖3 2018-2019年寧夏皮膚炭疽人群分布情況Fig.3 Population distribution of the incidence of anthrax in Ningxia from 2018 to 2019

表1 2018-2019年炭疽檢測結(jié)果Tab.1 Detection rate Bacillus anthracis from 2018 to 2019

圖4 炭疽芽胞桿菌鑒定結(jié)果 Fig.4 Identification results of B. anthracis

2.2.2采樣前后使用抗生素對炭疽芽胞桿菌分離率的影響 在45例感染病例中有14例采樣前未使用抗生素類藥物，共分離培養(yǎng)到炭疽芽胞桿菌9株，分離率為64.29%；剩余31例感染病例在采樣前均口服或靜滴過抗生素類藥物，僅分離培養(yǎng)到炭疽芽胞桿菌3株，分離率為9.68%，運用Real-time PCR方法的檢測陽性率為100%(表2)。

表2 標本采集用藥情況與炭疽芽胞桿菌分離情況Tab.2 Antibiotic administration and detection rate of B. anthracis in collected specimens

2.3Real-time PCR檢測結(jié)果 對疑似皮膚炭疽患者病灶采集的滲出液標本進行Real-time PCR檢測，結(jié)果顯示，陽性標本的滲出液可同時檢測出3種基因的熒光信號，3條擴增曲線均呈現(xiàn)典型S型，陰陽性對照成立，且Ct值均小于35。Real-time PCR共檢測70份樣本，其中陽性45份，檢出率64.29%。Real-time PCR檢出率明顯高于分離培養(yǎng)檢出率(表1)。

3 討 論

炭疽主要流行于我國的農(nóng)牧地區(qū)，是一種常見的人獸共患病。炭疽桿菌是革蘭陽性需氧芽胞桿菌, 其芽胞抵抗力極強，可在土壤和動物皮毛等環(huán)境中長期存在[7]。人主要通過接觸病畜及其產(chǎn)品或食用病畜的肉類而被感染。我國30多個省市發(fā)生過炭疽疫情，西北地區(qū)為炭疽老疫區(qū)[8]。寧夏地處我國西北部，回族人口比重大，飲食以牛羊肉為主。

自2004年開始寧夏一直有人間疫情報告，而2018年報告的皮膚炭疽感染病例接近歷年的總病例數(shù)，當年寧夏衛(wèi)生健康委和農(nóng)牧部門聯(lián)合對發(fā)病縣區(qū)進行了宣傳和疫源地消毒工作，2019年病例數(shù)有所下降，但發(fā)病數(shù)仍超出2017年之前的各年份。2018年雖然進行了嚴格的防控和疫源地消毒工作，但永寧縣和賀蘭縣仍然有不少病例產(chǎn)生；而相關(guān)部門并未對疫源地消毒進行效果評價，疫源地可能存在消毒不徹底風(fēng)險；2019年新增了原州區(qū)、興慶區(qū)和彭陽縣3個發(fā)病縣區(qū)，均為2018年發(fā)病縣區(qū)的周邊縣區(qū)；推測原因為炭疽菌有隨著雨水遷移的風(fēng)險。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，寧夏皮膚炭疽病例集中在7-9月份，8月份達到峰值；這主要與夏季雨水充沛，且人們部分皮膚暴露多有關(guān)。人群分布特點是男性發(fā)病多于女性，主要以從事養(yǎng)殖或屠宰的青壯年為主；牲畜的宰殺、放牧以及販賣等活動大部分都要男性承擔，增加了與炭疽病原接觸的機會；皮膚炭疽病例分布在11個縣區(qū)，病例報告的縣區(qū)均為牛羊養(yǎng)殖，宰殺交易頻繁的地區(qū)。從流行病學(xué)數(shù)據(jù)上分析寧夏皮膚炭疽流行病學(xué)特征和感染途徑與其他省情況基本一致[9-11]。

本研究顯示，2018-2019年檢測的70份樣本中共分離得到12株炭疽芽胞桿菌，檢出率僅為17.14%。結(jié)合流行病學(xué)資料發(fā)現(xiàn)，對患者在使用抗生素類藥物之前采樣，檢出率明顯高于使用抗生素類藥物之后采樣。這一結(jié)果與國內(nèi)部分學(xué)者的研究結(jié)果具有一致性[12-14]。分析寧夏炭疽芽胞桿菌分離率較低的原因除了與被采樣患者是否使用抗生素類藥物有關(guān)外，還有以下幾個原因：①采集的標本種類單一，應(yīng)采集與疑似患者病例相關(guān)的被宰家畜及土壤樣本，以提高炭疽芽胞桿菌檢出率；②省級以下疾控實驗室檢測能力較低。由于寧夏皮膚炭疽樣本是各市縣區(qū)采樣送至省級疾控中心進行檢測，一定程度上影響了采樣時機和檢測時間。③可能在患者病灶中存在其它生長速度較快的細菌，且缺少選擇性培養(yǎng)基針對炭疽芽胞桿菌增菌，從而導(dǎo)致目標菌分離率較低。

按中國現(xiàn)行炭疽標準規(guī)定：實驗室確診病例需分離到炭疽芽胞桿菌或抗體四倍升高[15]，此方法存在耗時長且不易采到恢復(fù)期血清的缺點，并不利于疫情控制。近幾年分子生物學(xué)技術(shù)在炭疽檢測和鑒定中被充分運用[16-17]。但由于普通PCR技術(shù)耗時較長，不利于疫情的快速判定。本研究發(fā)現(xiàn)在檢測的樣本中，Real-time PCR檢測陽性率明顯高于分離培養(yǎng)陽性率，同時患者服用抗生素后仍然能用此方法檢出，因此可在實際工作中將Real-time PCR技術(shù)與傳統(tǒng)細菌學(xué)檢測方法相結(jié)合，提供完整的實驗室診斷證據(jù)。此外由于核酸提取方法不統(tǒng)一以及假陽性問題等缺陷，應(yīng)將Real-time PCR檢測結(jié)果與臨床癥狀和細菌學(xué)培養(yǎng)結(jié)果相結(jié)合對病例進行判斷。

為了能夠更好的控制和預(yù)防寧夏皮膚炭疽疫情，結(jié)合上述流行病學(xué)資料和實驗室檢出情況，建議采取以下防控措施：①每年應(yīng)在疫情高發(fā)期之間，定期向群眾宣傳教育，特別是發(fā)生炭疽疫情的地區(qū)及周邊養(yǎng)殖區(qū)的農(nóng)牧民，增強群眾的安全防范意識；②對皮膚炭疽疫源地開展科學(xué)有效的消毒工作，并定期進行消毒效果評價；③建立衛(wèi)生和農(nóng)牧部門的聯(lián)合防控作用機制，確保信息及時互通；④強化省級疾控對基層疾控和醫(yī)療機構(gòu)的指導(dǎo)作用，提高實驗室檢測人員炭疽病原學(xué)檢測技術(shù)。

利益沖突：無