馬 杰，鄭禮鈞，唐 靜，李三景，霍玉奇

漢坦病毒(Hantavirus, HV)屬于布尼亞病毒目(Bunyavirales)、漢坦病毒科(Hantaviridae)、正漢坦病毒屬(Orthohantavirus)，是分布最廣泛的人獸共患病病毒之一[1-2]。漢坦病毒是一種分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒，其基因組有大(L)、中(M)、小(S)3個(gè)片段組成，依次編碼病毒RNA依賴(lài)的RNA聚合酶、包膜糖蛋白(Gc和Gn)以及核衣殼蛋白(NP)[2-4]。HV主要通過(guò)吸入被感染嚙齒動(dòng)物尿液和糞便產(chǎn)生的氣溶膠，進(jìn)食病毒污染的食物，接觸被感染嚙齒動(dòng)物唾液傳播給人類(lèi)，鮮有因被嚙齒動(dòng)物咬傷而被傳染的報(bào)道[5-6]。盡管HV在其天然宿主嚙齒動(dòng)物中不會(huì)引起明顯的疾病，但HV可能在其機(jī)會(huì)和終末宿主人類(lèi)中導(dǎo)致兩種嚴(yán)重的綜合癥，一種是由舊世界HV引起的腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)，例如亞洲的漢灘病毒(hantaan virus, HTNV)和漢城病毒(seoul virus, SEOV)，歐洲的普馬拉病毒(puumala virus, PUUV)和多布拉法-貝爾格萊德病毒(dobrava-belgrade virus, DOBV)等，一種是由新世界HV引起的HV心肺綜合征(Hantavirus cardiopulmonary syndrome，HCPS)，例如美洲的辛諾柏病毒(sin nombre virus, SNV)和安德斯病毒(andes virus, ANDV)等[7-8]。

我國(guó)自1955年以來(lái)一直將HFRS視為重要的公共衛(wèi)生事件[9]。我國(guó)主要以HTNV和SEOV為主要流行株[10]。自1963年河南省駐馬店正陽(yáng)縣首次報(bào)告HFRS病例以來(lái)，HFRS對(duì)河南省的公共衛(wèi)生構(gòu)成的威脅持續(xù)上升。但目前河南省未見(jiàn)從患者中成功分離到HV的報(bào)道，一直缺少HFRS患者HV分離株基因分型或基因亞型的分布和分子生物學(xué)特征分析研究。為此本研究通過(guò)提取HFRS患者血清中HV RNA并擴(kuò)增S片段和M部分片段核苷酸序列，與已分離到的國(guó)內(nèi)其他相對(duì)應(yīng)的基因序列進(jìn)行同源分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，明確本研究中HV分離株的基因型別和分子特征。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 2017-2018年就診于河南省鄭州市第六人民醫(yī)院且臨床診斷為HFRS的患者血清標(biāo)本32份。

1.2病毒RNA提取 采用TaKaRa Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0核酸提取試劑盒(寶生物工程大連有限公司)，按步驟提取病毒RNA。

1.3引物的設(shè)計(jì)及合成 參考文獻(xiàn)[11-12]，并根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中HV基因序列，設(shè)計(jì)5組半巢式引物。3組擴(kuò)增HTNV S片段的核苷酸序列：HTNV-S1F/HTNV-S740R/HTNV-S1160R、HTNV-S357F/HTNV-S595F/HTNV-S1160R和HTNV-S357F/HTNV-S934F/HTNV-S1702R；1組擴(kuò)增SEOV 部分S片段核苷酸序列：SEOV-S1F/SEOV-S207F/SEOV-S963R；1組擴(kuò)增HTNV M部分片段核苷酸序列：HTNV-M55F/HTNV-M107F/HTNV-M939R(表1)。

表1 S和M部分片段序列半巢式PCR擴(kuò)增引物引物詳細(xì)信息Tab.1 S and partial M segment sequences of primers used for hemi-nested PCR

1.4半巢式PCR和測(cè)序 以上述血清標(biāo)本中提取的RNA為模板，采用RevertAid first strand cDNA synthesis kit(賽默飛世爾科技有限公司)按說(shuō)明書(shū)合成cDNA。先分別用上述引物HTNV-S357F/HTNV-S595F/HTNV-S1160R和SEOV-S1F/SEOV-S207F/SEOV-S963R擴(kuò)增S部分片段序列，確定陽(yáng)性樣本。然后再用其他引物擴(kuò)增相應(yīng)片段序列。PCR分兩輪進(jìn)行，反應(yīng)條件相同，具體為94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min；擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，若擴(kuò)增條帶大小與預(yù)期片段大小相同，則表明為特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5核苷酸序列分析 采用Contig Express軟件對(duì)S片段序列進(jìn)行校對(duì)和拼接，應(yīng)用DNAStar軟件內(nèi)置的Editseq 程序?qū)片段和M部分片段核苷酸序列進(jìn)行編輯，使用該軟件中Megalign程序?qū)塑账嵝蛄羞M(jìn)行同源性分析。采用MEGA X軟件用鄰位相連法(neighbor-joining, NJ)分別對(duì)S片段和M部分片段核苷酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。它們對(duì)應(yīng)的最優(yōu)模型分別是GTR+G和T92+G，bootstrap值統(tǒng)一設(shè)置為1 000次重復(fù)。用于構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)的序列均來(lái)自GenBank。

2 結(jié) 果

2.1陽(yáng)性標(biāo)本篩檢及分型 從收集到的32份血清標(biāo)本提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，分別用HTNV-S357F/HTNV-S595F/HTNV-S1160R和SEOV-S1F/SEOV-S207F/SEOV-S963R引物，經(jīng)半巢式PCR擴(kuò)增，其中16份標(biāo)本擴(kuò)增出特異性條帶。對(duì)擴(kuò)增條帶進(jìn)行回收和測(cè)序，結(jié)果表明16位患者均是HTNV引起的HFRS。16位HTNV患者主要分布在許昌5例，平頂山2例，漯河2例，周口3例，駐馬店2例，商丘1例，濮陽(yáng)1例。

2.2S片段和M部分片段的核苷酸序列編輯 用HTNV特異性引物擴(kuò)增S片段和M部分片段核苷酸序列。經(jīng)測(cè)序，序列拼接和校正后，分別得到16株S片段序列和16株M部分片段序列。結(jié)果表明16位患者均為HTNV陽(yáng)性患者。S片段的長(zhǎng)度為1 701 bp或1 702 bp；M部分片段的長(zhǎng)度為732 bp。整理后的序列遞交NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，S片段和M部分片段的登錄號(hào)分別為MN478382-MN478397 和MN478398-MN478413。

2.3同源性分析 分別用S片段和M部分片段序列對(duì)16株HTNV進(jìn)行同源性分析。16株HTNV中的HN2018/138株與其余15株相比核苷酸序列差異較大，同源性分別為91.4%～92.1%(S片段)和83.2%～84.4%(M部分片段)；其余15株HTNV同源性高，分別為97.1%～100%(S片段)和96.9%～99.9%(M部分片段)。HN2018/138株的核苷酸序列經(jīng)基于局部比對(duì)搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool, BLAST)檢索后，發(fā)現(xiàn)其S片段序列與陜西的SXRn20120013株和XAAa10091712株最相近(>98.1%)，其M部分片段序列與陜西的XAAa10091712株和貴州的Q32株最相近(97.8%)。

2.4系統(tǒng)發(fā)生分析 利用S片段核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，16個(gè)分離株聚集成簇，從系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)上可以看出其中15株親緣關(guān)系較近，分布較集中，而HN2018/138株單獨(dú)形成一個(gè)分支，它與陜西和貴州的病毒株親緣關(guān)系較近。HN2018/138株為S2亞型，其他15株病毒分離株為S5亞型。各分離株成簇情況在基于M部分片段構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)與基于S片段構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)上基本保持一致(圖1、2)。

圖1 S片段核苷酸系統(tǒng)發(fā)生分析Fig.1 Phylogenetic tree of HV based on complete S segments

圖2 部分M片段核苷酸系統(tǒng)發(fā)生分析Fig.2 Phylogenetic tree of HV based on partial M segments

3 討 論

流行性出血熱是我國(guó)法定乙類(lèi)傳染病，又稱(chēng)腎綜合征出血熱(HFRS)。自1981年實(shí)施綜合預(yù)防措施以來(lái)，包括河南省在內(nèi)的一些省份的HFRS發(fā)病率已大大降低[13]。然而，近些年河南省HFRS患者人數(shù)激增，從2014年的138例增加到2018的416例。我國(guó)通過(guò)法定傳染病上報(bào)系統(tǒng)上報(bào)的HFRS病例未對(duì)HTNV或SEOV感染進(jìn)行區(qū)分[5]。近些年研究人員從流行特征方面對(duì)河南省許昌、駐馬店、周口等地區(qū)的HFRS患者進(jìn)行了分析。本研究從病毒基因入手，利用半巢式PCR技術(shù)，分別用HTNV和SEOV特異性引物，從16份血清標(biāo)本中成功擴(kuò)增出病毒基因組片段，經(jīng)序列分析均為HTNV，無(wú)SEOV。系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析也證實(shí)16株病毒株為HTNV。

河南省是我國(guó)HFRS的主要疫區(qū)之一，也是我國(guó)最早發(fā)現(xiàn)SEOV的地區(qū)。根據(jù)流行性出血熱監(jiān)測(cè)及流行病學(xué)研究結(jié)果表明，河南省存在著HTNV和SEOV兩種病毒株。20世紀(jì)90年代河南省主要的HFRS疫區(qū)已被證實(shí)存在單純的HTNV型、SEOV型和混合型疫區(qū)3種。孫黎等2005年對(duì)河南省安陽(yáng)、開(kāi)封、駐馬店、南陽(yáng)等7個(gè)HFRS高發(fā)地區(qū)捕獲的嚙齒類(lèi)動(dòng)物檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)褐家鼠、黃胸鼠和小家鼠攜帶的病毒均為SEOV[14]。杜燕華等對(duì)駐馬店確山縣捕獲的嚙齒類(lèi)動(dòng)物檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)其攜帶的病毒均為SEOV[15]。有研究證實(shí)在法國(guó)捕獲的褐家鼠中持續(xù)檢測(cè)到SEOV，但在歐洲沒(méi)有人感染SEOV的報(bào)道[16]。本研究中分離到的病毒株型別與前人不一致，可能原因有：1)前人研究的是HV宿主動(dòng)物；2)本研究的樣本量太小，并不能反映河南全境的真實(shí)情況；3)因?yàn)橛蒘EOV引發(fā)HFRS疾病的嚴(yán)重程度比由HTNV引發(fā)HFRS疾病的嚴(yán)重程度要輕[17-18]，造成SEOV引發(fā)的HFRS患者未入院治療或就近入院治愈。這些原因可能導(dǎo)致本研究從HFRS患者血清中只檢測(cè)到HTNV。

16位HTNV陽(yáng)性HFRS患者主要集中在河南省中部地區(qū)。16株HTNV中15株病毒株在S片段和M部分片段的核苷酸序列同源性都大于96%， 而HN2018/138株與其余15株同源性為91.4%～92.1%(S片段)和83.2%～84.4%(M部分片段)。根據(jù)前人的分子流行病學(xué)研究結(jié)果，我國(guó)流行的HTNV至少可分為9個(gè)亞型[13]。HN2018/138株屬于S2亞型，與其他15株不同(S5)。而同地區(qū)HV分離株傾向于聚集在同一分支，有明顯的地域聚集性[19-20]。本研究中樣本編號(hào)為HN2018/146的患者入院20 d前從平頂山葉縣到山東務(wù)工，15 d前開(kāi)始發(fā)熱。根據(jù)HTNV感染在突發(fā)高熱等臨床癥狀之前，通常有大約 2～4周的潛伏期[21]。該患者可能在平頂山葉縣感染了HTNV。經(jīng)BLAST分析發(fā)現(xiàn)HN2018/146株與來(lái)自山東省的分離株之間的同源性低于96%，而與來(lái)自平頂山魯山HN2018/134分離株之間的同源性高于98%。系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)顯示HN2018/146株與HN2018/138株外的其他分離株在同一分支。因此樣本編號(hào)為HN2018/146的患者在平頂山感染HTNV的可能性較大。樣本編號(hào)為HN2018/138的患者 1個(gè)月前從河南省周口市到江蘇省南京市務(wù)工，5 d前開(kāi)始發(fā)熱。經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)HN2018/138株與來(lái)自江蘇省的分離株之間的同源性為86.8%～89.5%(S片段)和82.8%(M部分片段)，差異較大。進(jìn)一步與周口市分離株HN2017/80株和HN2017/82株進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，它們的同源性為92.0%～92.2%(S片段)和83.3%～84.4%(M部分片段)，差異也較大，但S片段的同源性相對(duì)較高。同樣在駐馬店分離的兩株序列的同源性為高于98%(S片段和M部分片段)；在許昌分離的5株序列的同源性高于99%(S片段和M部分片段)。通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)經(jīng)Blast后，發(fā)現(xiàn)HN2018/138株S片段序列同源性與陜西的SXRn20120013株和XAAa10091712株最相近(>98.1%)，其M部分片段同源性與陜西的XAAa10091712株和貴州的Q32株最相近(97.8%)。系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析同樣表明HN2018/138株與自陜西和貴州的病毒株在同一分支，但樣本編號(hào)為HN2018/138的患者未曾去過(guò)陜西和貴州。因?yàn)镚enBank數(shù)據(jù)庫(kù)中河南和江蘇可用的HTNV序列較少，推測(cè)HN2018/138株可能為本地變異株，或省外輸入病毒株。

利益沖突：無(wú)