楊 夢,王 鵬,袁 輝,劉曉青,周海健，徐曉倩,熊長輝,黃星魁,謝 昀,潘歡弘

巴爾通體病是一種人獸共患病，其病原體是巴爾通體。巴爾通體是一群寄生于哺乳動物紅細(xì)胞內(nèi)的革蘭陰性、營養(yǎng)要求苛刻、兼性需氧桿菌,可引起貓抓病、戰(zhàn)壕熱、卡里翁氏病、心內(nèi)膜炎、視神經(jīng)炎菌血癥等疾病[1]。作為一類新發(fā)傳染病病原體，巴爾通體的自然宿主包括鼠、兔、貓、犬、蝙蝠、牛、鹿、麋鹿等。為了解江西省鼠類動物中巴爾通體攜帶情況，本研究于2018-2019年采集鼠形動物肝、脾組織進(jìn)行巴爾通體分離培養(yǎng)，并對獲得的巴爾通體菌株進(jìn)行全基因組測序和基因多態(tài)性分析，為巴爾通體感染的預(yù)防控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1樣本來源 本研究2018-2019年利用鼠傳疾病監(jiān)測項(xiàng)目采集了130只鼠形動物的肝、脾組織。其中銅鼓縣62只、廣信區(qū)26只、橫峰縣22只、南城縣12只、廣豐區(qū)8只。

1.2試劑及儀器 胰酶大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)和胰酶大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)購自英國OXOID公司，DNA核酸提取試劑盒購自QIAGEN公司，酶購自大連寶生物工程有限公司；組織研磨器Tissuelyser購自QIAGEN公司，CO2培養(yǎng)箱購自美國NUAIRE公司，PCR擴(kuò)增儀、成像儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方 法

1.3.1樣本采集 用鼠籠或鼠夾捕獲鼠形動物，所有的鼠形動物依據(jù)外形(體長、體型、毛色、耳長、尾長)、頭骨、牙齒的特征進(jìn)行分類鑒定，然后無菌操作采集肝、脾臟器，置含有1 mL保存液的2.0 mL凍存管中，-80 ℃保存。

1.3.2菌株分離培養(yǎng)和鑒定 每份樣本無菌取約25 mg肝或脾組織，加入600 μL TSB后，用組織研磨器研碎，混勻，吸取 0.2 mL組織懸液接種于含 5%脫纖維羊血的TSA平板上，置于36 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3 d后，挑取疑似菌落進(jìn)行鑒定，直至第20 d。

1.3.3屬水平特異性基因的PCR檢測 挑取適量菌落用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，方法參照說明書步驟。屬水平特異性基因PCR擴(kuò)增目的基因?yàn)間ltA，引物序列、反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件參考文獻(xiàn)[2]。

1.3.4全基因組測序和序列分析 全基因組測序委托北京博鰲鷹飛生物科技有限公司完成。參照文獻(xiàn)的方法進(jìn)行序列處理和分析、進(jìn)化樹構(gòu)建[3]。本研究中完成測序的14株巴爾通體基因組序列已提交國家微生物科學(xué)數(shù)據(jù)中心，被接收錄入微生物組學(xué)數(shù)據(jù)庫，項(xiàng)目編號為NMDC10017684。另外從NCBI數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov)下載已公布的30株巴爾通體的全基因組序列作為參考序列納入分析。

2 結(jié) 果

2.1攜帶巴爾通體的鼠形動物構(gòu)成 本次所捕獲的有黑線姬鼠、黃毛鼠、社鼠、褐家鼠、黃胸鼠、小家鼠、臭鼬鼱等鼠形動物。其中野鼠84只，以黑線姬鼠為主，占64.62%；家鼠46只，以褐家鼠為主，占35.38%。廣信區(qū)、橫峰縣、銅鼓縣以黑線姬鼠為主，南城縣均為褐家鼠。從130只鼠類動物的組織樣本中分離巴爾通體14株，總攜帶率為10.77%。黃毛鼠攜帶率最高(2/6)，其次為黑線姬鼠(8/72)、褐家鼠(3/27)、臭鼬鼱(1/12)(表1)。

表1 江西省鼠形動物中巴爾通體檢出率Tab.1 Bartonella infection in myomorphs in Jiangxi Province

2.2巴爾通體分離培養(yǎng)與PCR結(jié)果 130份組織樣本進(jìn)行巴爾通體分離培養(yǎng)，檢出14株疑似菌株。培養(yǎng)結(jié)果：培養(yǎng)3～5 d后可見灰白色，略透明，邊緣光滑或粗糙的圓形凸起菌落，革蘭染色鏡檢為陰性小桿菌。PCR結(jié)果：14株疑似菌株進(jìn)行PCR檢測，均獲得379 bp的擴(kuò)增條帶，判斷為gltA基因陽性(圖1)。

1、18：DL1000 Marker；2-15：疑似菌株；16：陰性對照(去離子水)；17：陽性對照(陽性參考菌株提取的核酸)。圖1 疑似菌株P(guān)CR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of PCR products of suspected strains

2.3全基因組分析 將本研究分離的14株巴爾通體進(jìn)行全基因組測序，將序列和公共數(shù)據(jù)庫已公布的26個不同種的30株巴爾通體全基因組構(gòu)建聚類樹(圖2)?？傮w而言，相同的種在同一分支，本研究分離的14株巴爾通體分布在5個不同的分支，提示分為5種基因型。根據(jù)與30株參考菌株全基因組序列的遺傳進(jìn)化關(guān)系，可以推測分支2的4株菌為Bartonellatribocorum，其余4個分支的10株巴爾通體沒有同26個種的菌株序列聚在一起。分支2包含的4株菌分離自3個縣的3種宿主，分支4包含的4株菌分離自2個縣的2種宿主，分支5包含的4株菌分離自3個縣的1種宿主。

圖2 14株本研究分離菌株與30株巴爾通體參考菌株全基因組序列基因多態(tài)性分析Fig.2 Analysis of gene polymorphisms of 14 Bartonella isolates obtained in this study and 30 reference strains of Bartonella on the basis of whole genome sequences

3 討 論

巴爾通體是一類古老又新鮮的人獸共患病病原體，近年來，國內(nèi)外研究均有從不同宿主分離巴爾通體的文獻(xiàn)報(bào)道。國外研究報(bào)道英國、美國東南部巴爾通體的鼠形動物帶菌率較高，分別為 62.20%和 42.20%[4-5]。我國已在福建、黑龍江、內(nèi)蒙古、浙江、寧夏、廣西、海南、山東、廣東、上海、云南、河南、青海、山西等省分別在鼠、貓、犬、華南虎、蜱、蚤中分離或檢測出巴爾通體病原菌[2,6-13]。

在本次研究中，江西省首次從鼠類動物中分離到巴爾通體病原體，獲得江西省鼠形動物巴爾通體的攜帶率及基因序列，攜帶率低于廣東(19.47%)[14]、浙江(15.20%)[9]、福建(12.34%)[1]，高于廣西(2.3%)[11]、海南(9.2%)[12]，填補(bǔ)江西省巴爾通體攜帶的研究空白。本次捕獲的鼠種有黑線姬鼠、黃毛鼠、社鼠、褐家鼠、黃胸鼠、小家鼠、臭鼬鼱，陽性檢出以野鼠(黑線姬鼠、黃毛鼠)為主，其次是褐家鼠、臭鼬鼱，提示攜帶巴爾通體的鼠形動物呈多樣性。野鼠主要分布于農(nóng)田、山坡、丘陵灌木等生存環(huán)境，這些生存環(huán)境往往是人類生產(chǎn)生活的主要場所，有文獻(xiàn)報(bào)道野鼠的棲息地往往是巴爾通體的自然疫源地，使得人類感染的幾率大大增加，應(yīng)引起關(guān)注[15]。

本次基因組序列研究中，巴爾通體基因型分布在5個不同的分支，即提示有5種不同基因型的巴爾通體，表明江西鼠形動物巴爾通體基因多樣性大，種群結(jié)構(gòu)復(fù)雜；其中分支2的4株巴爾通體與特利波契巴爾通體(B.tribocorum)聚集成簇，分離自黑線姬鼠、黃毛鼠、褐家鼠3種鼠種，表明宿主動物廣泛。國內(nèi)文獻(xiàn)[16]報(bào)道這種基因型分布于我國云南、福建、海南、廣東、臺灣地區(qū)，與人類巴爾通體病有關(guān)，可引起貓抓病、菌血癥、心內(nèi)膜炎、發(fā)熱等[17]。其余4個分支的10株巴爾通體沒有同26個種的菌株序列聚在一起，提示與參考菌株遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。目前已公布全基因組序列的巴爾通體有26個種，還需要測序獲得更多種的巴爾通體補(bǔ)充數(shù)據(jù)庫，以建立全面的巴爾通體全基因組數(shù)據(jù)庫，用于種的鑒定。同一分支的巴爾通體分離自不同的地區(qū)、不同的宿主，不存在地區(qū)或者宿主特異性，提示不同地區(qū)、不同宿主間存在菌株的交流和傳播。

基于江西省鼠形動物巴爾通體的宿主、基因型的多樣性以及鼠形動物宿主攜帶與致病相關(guān)的基因型，作為潛在病原體導(dǎo)致人類感染巴爾通體疾病的風(fēng)險加大。同時隨著生態(tài)環(huán)境的不斷改變，快捷的交通，人類的頻繁活動，鼠形動物通過與其他動物及人類的密切接觸可能把攜帶的巴爾通體傳播給其他宿主，并造成人類巴爾通體病的隱性感染，因此，為應(yīng)對不斷增長的巴爾通體引起感染的疾病的流行，應(yīng)加強(qiáng)了解巴爾通體的流行特征、致病性、遺傳多樣性，加強(qiáng)鼠形動物間巴爾通體的調(diào)查研究，并采取預(yù)防措施加以控制。

利益沖突：無