范萃

摘要：2019冠狀病毒?。?019-nCoV/SARS-CoV-2）疫情已成為國(guó)際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件。為應(yīng)對(duì)突發(fā)病毒疫情事件，加快病毒檢測(cè)并提高檢測(cè)準(zhǔn)確性變得非常重要。中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)《新型冠狀病毒肺炎診療方案》規(guī)定了核酸檢測(cè)和基因測(cè)序作為確診病例的方法，檢測(cè)結(jié)果是對(duì)潛伏期人群、疑似病例人群和隔離期人群的新型冠狀病毒（2019-nCoV/SARS-CoV-2）進(jìn)行確診的重要依據(jù)。本文對(duì)核酸檢測(cè)結(jié)果判定及要點(diǎn)進(jìn)行了分析，總結(jié)了經(jīng)驗(yàn)并對(duì)未來(lái)發(fā)展進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：新型冠狀病毒;核酸檢測(cè);經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

引言：

2019新型冠狀病毒（2019-nCoV/SARS-CoV-2，以下簡(jiǎn)稱新冠病毒）是一種新型β屬冠狀病毒，屬于單鏈RNA病毒，可引起人類呼吸道感染，基因組序列約由29 kb構(gòu)成，擁有10個(gè)基因，可有效編碼10個(gè)蛋白。2019年12月突如其來(lái)的一場(chǎng)病毒疫情，引發(fā)對(duì)全球健康的關(guān)注，再次讓我們體會(huì)重視生命，挽救生命的意義。在核酸檢測(cè)過(guò)程中的各個(gè)環(huán)節(jié)中存在較多因素，本文將目前我院新冠病毒核酸檢測(cè)中的部分環(huán)節(jié)及其中可能影響核酸檢測(cè)結(jié)果的部分因素進(jìn)行描述。

一、新冠病毒核酸檢測(cè)方法

在疫情初期，我國(guó)最早采用的是高通量PCR檢測(cè)技術(shù)。隨著疫情的發(fā)展，這種檢測(cè)技術(shù)無(wú)法在國(guó)內(nèi)大量推廣。隨之而來(lái)，很多的廠家推出了基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）技術(shù)的試劑盒，這種檢測(cè)技術(shù)在國(guó)家衛(wèi)建委的推動(dòng)下得到了很大的推廣和應(yīng)用。目前我院新冠病毒核酸檢測(cè)針對(duì)的位點(diǎn)主要包含病毒基因組中2段保守基因序列，即以開(kāi)放讀碼框1ab（ORF1ab）、 核 殼 蛋 白 （N）基因作為檢測(cè)靶標(biāo)[4]。

二、新冠病毒核酸檢測(cè)樣本核酸提取方法及病毒核酸檢出情況

由于目前臨床常見(jiàn)鼻咽拭子樣本存在核酸檢出率較低的問(wèn)題，對(duì)提取方法及提取流程進(jìn)行有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)依據(jù)的選擇及優(yōu)化是有必要的。新冠病毒核酸檢測(cè)所采用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是臨床分子檢測(cè)中常用的檢測(cè)方法，在以往采用RT-PCR對(duì)病毒核酸進(jìn)行的檢測(cè)中，磁珠法是較為常用的核酸提取方法。此外因各檢測(cè)試劑盒要求，一步裂解釋放法也在臨床大量應(yīng)用。不同的病毒核酸提取方法因其提取產(chǎn)物濃度、純度的差別及對(duì)RNA的保護(hù)程度不同，一定程度上影響病毒核酸尤其是臨界陽(yáng)性樣本的核酸檢出。經(jīng)過(guò)我們自己初始實(shí)驗(yàn)，對(duì)我院7例已確診患者原始樣本（均為生理鹽水保存液的鼻咽拭子樣本）同時(shí)采用不同提取方法后的核酸檢測(cè)結(jié)果顯示，分別采用一步裂解釋放法及磁珠法提取后，PCR檢測(cè)的CT值無(wú)顯著差異（P>0.05）。

三、核酸檢測(cè)結(jié)果判定及要點(diǎn)分析

新型冠狀病毒感染的肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南（第五版），簡(jiǎn)稱”指南”中，核酸檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光RT.PCR方法，主要是對(duì)ORFlab和N兩個(gè)靶標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。采用同一份標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)的這兩個(gè)靶標(biāo)出現(xiàn)結(jié)果均為陽(yáng)性時(shí)，確認(rèn)為陽(yáng)性病例;若單個(gè)靶標(biāo)是陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果，需要重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，從采樣開(kāi)始再次進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果依舊是單個(gè)靶標(biāo)陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果，則確認(rèn)為陽(yáng)性。

第二種現(xiàn)象是，當(dāng)以兩種標(biāo)本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)同時(shí)出現(xiàn)單靶標(biāo)陽(yáng)性結(jié)果，確認(rèn)為陽(yáng)性病例;當(dāng)同種類型標(biāo)本經(jīng)過(guò)2次采樣檢測(cè)，2次單個(gè)靶標(biāo)均為陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果，可判定為陽(yáng)性病例。當(dāng)出現(xiàn)核酸檢測(cè)結(jié)果陰性時(shí)，為防止判定錯(cuò)誤，需要對(duì)檢測(cè)的影響因素進(jìn)行認(rèn)真排除，避免產(chǎn)生假陰性。產(chǎn)生假陰性的主要因素包括：樣本質(zhì)量差，比如口咽等部位的呼吸道樣本采樣質(zhì)量不好，有的沒(méi)有采到帶有病毒的上皮細(xì)胞，病毒含量低;樣本收集時(shí)間把控不好，過(guò)早或過(guò)晚;樣本采集后的保存不當(dāng)，溫度過(guò)高、保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng);運(yùn)輸和處理樣本不正確操作;檢測(cè)中技術(shù)問(wèn)題的原因，如沒(méi)有考慮到病毒變異、PCR抑制等。

當(dāng)出現(xiàn)不可確定的可疑情況，應(yīng)采用多種方法多種試劑重復(fù)實(shí)驗(yàn)，或采用敏感度更高的方法，如數(shù)字PCR方法進(jìn)一步確定。當(dāng)根據(jù)指南Ct值判斷時(shí)，規(guī)定的是無(wú)Ct值或Ct>40結(jié)果判斷為陰性結(jié)果;Ct值<37，為陽(yáng)性;當(dāng)Ct值在37-40灰度區(qū)間時(shí)，建議重復(fù)做實(shí)驗(yàn)，若重做結(jié)果ct值<40，擴(kuò)增曲線有明顯起峰，則判斷該標(biāo)本為陽(yáng)性，否則為陰性結(jié)果。需要強(qiáng)調(diào)的是，對(duì)病毒量低的標(biāo)本進(jìn)行病毒2019-nCoV/SARS-CoV-2核酸檢測(cè)，特別是潛伏期、疑似病例人員，更加需要仔細(xì)了解試劑盒的檢出限進(jìn)行實(shí)驗(yàn);應(yīng)結(jié)合標(biāo)本可能的病毒量選擇具有不同檢出限的試劑盒，并在檢測(cè)時(shí)注意影響因素，并可使用數(shù)字PCR方法進(jìn)一步確定，避免由于病毒量少而檢不出的現(xiàn)象，最終獲得準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。

四、經(jīng)驗(yàn)總結(jié)及展望

綜上所述，目前新冠病毒所致疾病其病理生理過(guò)程還未完全闡明，全國(guó)各臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方式未標(biāo)準(zhǔn)化，然而核酸檢測(cè)也有其局限性，加上其核酸檢測(cè)試劑盒研發(fā)時(shí)間緊迫，沒(méi)有足夠的評(píng)估及大樣本的臨床驗(yàn)證，同時(shí)也存在不同品牌產(chǎn)品的核酸試劑盒RT-PCR分析方法檢測(cè)結(jié)果會(huì)有不同，檢測(cè)效果良莠不齊，故對(duì)于臨床上新冠病毒核酸檢測(cè)結(jié)果為陰性或單通道陽(yáng)性的樣本均需要謹(jǐn)慎對(duì)待，考慮到各環(huán)節(jié)中可能造成結(jié)果不準(zhǔn)確的影響因素。各臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在現(xiàn)有指南和相關(guān)研究報(bào)道的基礎(chǔ)上，根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)室情況對(duì)新冠病毒核酸檢測(cè)全過(guò)程實(shí)施嚴(yán)格的質(zhì)量控制、制定合理的優(yōu)化自己的標(biāo)準(zhǔn)操作流程。同時(shí)，目前實(shí)驗(yàn)室已開(kāi)始檢測(cè)新冠病毒IgM及IgG抗體，更靈敏的核酸檢測(cè)方法如數(shù)字PCR也開(kāi)始應(yīng)用于新冠病毒的核酸檢測(cè)，部分研究團(tuán)隊(duì)著力于探索更加高效的新冠病毒實(shí)驗(yàn)室診斷模型，有望在新冠病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方面大大降低假陰性率;部分研究團(tuán)隊(duì)著力探索如何更快更便捷的開(kāi)展新型冠狀病毒核酸檢測(cè)技術(shù)，為更好更快地確診和篩查新冠病毒感染者提供事實(shí)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

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[2]高亭，徐仰玲，何小鵬，等.40例新型冠狀病毒肺炎的流行病學(xué)及臨床特征分析[J].中國(guó)呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志，2020，19（02）：148-153.

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[4]鐘慧鈺，趙珍珍，宋興勃，等.新型冠狀病毒核酸臨床檢測(cè)要點(diǎn)及經(jīng)驗(yàn)[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2020，41（5）：523-526.

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