張建普，馬麗利，周利鋒*

(1.河南省偃師市動物衛(wèi)生監(jiān)督所,河南 偃師 471900;2.上海啟盛生物科技有限公司，上海 201203)

犬瘟熱(canine distemper，CD)是由犬瘟熱病毒(canine distemper virus，CDV)引起的急性、高度接觸性傳染病。CDV屬于副黏病毒科、麻疹病毒屬，宿主范圍廣，可感染犬科、鼬科、浣熊科及多種野生動物，主要侵害易感動物的呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)，是當(dāng)前養(yǎng)犬業(yè)和毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)危害最大的病原之一[1]。19世紀(jì)60年代以來，CDV弱毒疫苗的使用使該病得到了控制，但是近年來，世界各地相繼出現(xiàn)了犬瘟熱的暴發(fā)[2-6]。隨著毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)和寵物產(chǎn)業(yè)在我國的不斷發(fā)展，犬瘟熱在各地毛皮動物養(yǎng)殖場和寵物養(yǎng)殖場也常有發(fā)生，給我國經(jīng)濟動物養(yǎng)殖業(yè)造成了經(jīng)濟損失。CDV是單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組全長15 690 nt，編碼核衣殼蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)、大蛋白(L)蛋白。其中H蛋白是CDV囊膜糖蛋白，對病毒本身和宿主都非常關(guān)鍵。病毒感染的起始階段需要借助H蛋白和宿主細(xì)胞受體結(jié)合來吸附于宿主細(xì)胞上；宿主針對H蛋白產(chǎn)生的保護性免疫反應(yīng)可以阻止CDV的感染[7]。另外，H基因在6個基因中變異率最高，因此成為研究CDV變異情況的主要目的基因[8]。本試驗從江蘇疑似犬瘟熱病犬的脾、肺和腸系膜淋巴結(jié)混合病料中成功分離了1株病毒，經(jīng)鑒定該病毒為CDV強毒株，并對其H基因全長序列進行了分析。

1 材料與方法

1.1 病料

江蘇某動物醫(yī)院疑似犬瘟熱病犬，采集其脾、肺和淋巴結(jié)。

1.2 細(xì)胞及主要試劑

表達犬淋巴細(xì)胞信號活性分子(SLAM，CD150)的Vero-SLAM細(xì)胞系由本實驗室保存。細(xì)胞生長液為含7%胎牛血清的DMEM，維持液為2%胎牛血清DMEM，Gibco胎牛血清購自Life Technologies，DMEM購自北京清大天一生物技術(shù)有限公司，CDV單克隆抗體購自北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司；羊抗鼠FITC熒光抗體購自Sigma。病毒RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0購自TaKaRa公司。PCR儀購自北京鼎昊源科技有限公司，型號：DHS96G；多樣品組織研磨機購自上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司，型號：Tiss-24；熒光倒置顯微鏡購自O(shè)LYPUS，型號：CKX41。

1.3 參考毒株

犬瘟熱活疫苗CDV-11株，購自齊魯動物保健品有限公司。

1.4 實驗動物

3月齡比格犬5只，購自上海交通大學(xué)農(nóng)學(xué)院；9～10周齡水貂、10～12月齡水貂各5只，購自江蘇啟東某貂場；9～10周齡狐貍5只，購自上海南匯某狐場。以上動物血清CDV中和效價均小于1∶4。

1.5 病料處理

將采集的病犬的臟器剪碎，按重量加入DMEM(含有1 000 IU/mL的青霉素和1 mg/mL的鏈霉素)，制成10%組織懸液，用多樣品組織研磨機將其研磨成勻漿，8 000 r/min 于4 ℃離心30 min，吸取上清，于-70 ℃保存。

1.6 病毒的分離培養(yǎng)

Vero-SLAM細(xì)胞長成單層后，接種準(zhǔn)備好的組織上清，37 ℃吸附1 h，然后加入1%維持液，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察，出現(xiàn)80%細(xì)胞病變(CPE)時收毒。同時設(shè)細(xì)胞對照。

1.7 TCID50測定

將病毒進行10倍的倍比稀釋，然后接種在覆蓋有Vero-SLAM細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個稀釋度5孔，100 μL/孔，置于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，觀察CPE，按照Reed-Muench法計算CDV滴度。

1.8 間接免疫熒光(IFA)鑒定

將病毒原液進行10倍的倍比稀釋，接種在覆蓋有每孔2×104個Vero-SLAM細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個稀釋度5孔，0.1 mL/孔，置于37 ℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4 d后，棄去培養(yǎng)基，用PBS(0.01 mol/L，pH值7.2)洗滌1次，每孔加入100 μL 75%乙醇，室溫固定30 min，棄去固定液，用PBS洗滌1次，自然干燥，加入1∶100稀釋的CDV單克隆抗體，80 μL/孔，37 ℃作用1 h，PBS洗3次，每次間隔5 min，然后加入1∶200稀釋的羊抗鼠熒光二抗，37 ℃作用1 h，PBS洗3次，每次間隔5 min，干燥后，在熒光顯微鏡下觀察，出現(xiàn)特異性亮綠色則為陽性，反之為陰性。

1.9 血凝試驗

參照《中華人民共和國獸藥典》附錄12，分別用1%的豚鼠、雞、豬、人“O”型紅細(xì)胞，對分離的第1代病毒進行血凝試驗，檢測病毒的血凝譜；同時，確定病毒感染材料中是否存在犬腺病毒(CAV)、犬副流感病毒(CPIV)或犬細(xì)小病毒(CPV)等外源病毒，此3種病毒均具有血凝性。

1.10 RT-PCR鑒定

1.10.1 引物設(shè)計和合成

根據(jù)Sanjay等[9]報道合成1對引物擴增N基因部分片段，N-F(5′-GTTAGCTAGTTTCATCCT-3′)和N-R(5′-GGTCCTCTGTTGTCTTGG-3′)，預(yù)期擴增419 bp片段。參考GenBank中CDV全基因參考序列(登錄號：AF378705)，利用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計1對引物擴增H基因，H-F(5′-CTCAGGTAGTCCARCAATG-3′)和H-R(5′-CCTCAGGGTATAGAATCTGGT-3′)，預(yù)期擴增2 007 bp片段。引物由上海生物工程有限公司合成。

1.10.2 病毒RNA提取

按照病毒RNA提取試劑盒的產(chǎn)品說明書提取病毒RNA。

1.10.3 RT-PCR檢測

按照RNA PCR Kit的產(chǎn)品說明書進行RT-PCR。

N基因PCR程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，擴增30個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

H基因PCR程序為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，擴增30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.11 致病性試驗

攻毒組3只犬，每只靜脈接種2.0 mL，鼻內(nèi)1.0 mL 分離的第1代細(xì)胞毒(104.625TCID50/mL)，對照組1只，接種DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，接種量和接種途徑與攻毒組一致。觀察10 d，然后剖檢，采集脾、肺和腸系膜淋巴結(jié)，按照1.6所述分離病毒。按照表1安排進行試驗。參考文獻[10]制定臨床評分系統(tǒng)，正常為0分；死亡為20分；與正常體溫相比，變化不大于0.5 ℃記為1分，大于0.5 ℃記為2分。見表2。

表1 動物分組

表2 動物感染犬瘟熱臨床評分標(biāo)準(zhǔn)

1.12 H基因測序和分析

按照TaKaRa的RNA PCR Kit說明書進行RT-PCR。PCR程序為94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，擴增30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，按照DNA純化試劑盒說明書回收目的條帶，由上海生物工程有限公司測序。使用DNAStar 7.1對測得H基因序列進行比對分析，NetNGlyc 1.0 對推導(dǎo)的氨基酸序列進行分析，使用Mega 5.02繪制系統(tǒng)發(fā)生樹。

表3 參考基因序列

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離

在Vero-SLAM細(xì)胞上接種病料組織懸液，48 h出現(xiàn)合胞體、細(xì)胞溶解、胞漿空泡化、細(xì)胞脫落等細(xì)胞病變(CPE)(見圖1)。測定第1代細(xì)胞毒滴度為104.625TCID50/mL。

2.2 間接免疫熒光鑒定

感染分離病毒的Vero-SLAM細(xì)胞有特異性綠色熒光，對照細(xì)胞無熒光(見圖2)。

A． 接種病料的Vero-SLAM細(xì)胞；B.細(xì)胞對照圖1 Vero-SLAM細(xì)胞接種病料組織后的形態(tài)變化(100×)

A.感染分離病毒后的Vero-SLAM細(xì)胞；B.細(xì)胞對照圖2 IFA鑒定結(jié)果(200×)

2.3 血凝譜和外源病毒檢測

分離病毒不能凝集豚鼠、雞、豬、人“O”型紅細(xì)胞，說明分離株無血凝活性，且病毒感染材料中無CAV、CPV和CPIV。

2.4 RT-PCR鑒定

通過1%瓊脂糖電泳，分離病毒RT-PCR產(chǎn)物大小為419 bp，與預(yù)期相符(見圖3)。

M.100 bp DNA Marker；1.CDV YD株；2.陽性對照圖3 N基因RT-PCR擴增結(jié)果

2.5 對不同動物的致病性

接種分離病毒后第5～7天，動物開始出現(xiàn)體溫升高、精神沉郁、食欲減退、鼻鏡干燥、眼鼻有漿液性分泌物等癥狀，觀察至21 d，未見神經(jīng)癥狀。1號狐貍于攻毒后第8天患急性犬瘟熱死亡。第21天剖檢可見腸系膜淋巴結(jié)腫大，小腸黏膜出血，肺臟肉變，出血，脾臟腫大，出血等病變。攻毒后第4天開始可以從糞便和鼻拭子中檢測到CDV。對照組未觀察到異常癥狀和病理變化。臨床累計得分表明，攻毒組動物得分明顯高于對照組，說明攻毒組動物均出現(xiàn)犬瘟熱癥狀。詳情見表4。以上結(jié)果鑒定分離的病毒為CDV，命名為YD株。

表4 分離病毒攻毒后動物21 d評分累計結(jié)果

2.6 H基因測序和分析

利用H基因特異性引物，經(jīng)PCR擴增后獲得大小為2 007 bp的片段，與預(yù)期大小相符(見圖4)。YD株H基因僅含有1個ORF，全長1 824 bp，編碼607個氨基酸。YD株H基因與強毒株核苷酸同源性為92.8%～99.7%，氨基酸同源性為93.0%～99.7%，與國內(nèi)強毒株核苷酸同源性較近，為98.4%～99.7%，而與疫苗株核苷酸同源性較遠(yuǎn)為91.2%～91.5%，氨基酸同源性為90.3%～91.2%。利用Mega 5.02繪制系統(tǒng)發(fā)生樹(見圖5)。從系統(tǒng)發(fā)生樹中可以看出，CDV分為兩大分支，疫苗株和野毒株，后者分5個基因型，YD株與國內(nèi)野毒株在一個大分支中，屬于國內(nèi)流行基因型Asia-1型。此外，CDV YD株推導(dǎo)的H蛋白氨基酸中有保守的12個半胱氨酸(Cys)殘基，9個潛在天冬酰胺連接(N-)糖基化位點，分別在第19～21、149～151、309～311、391～393、422～424、456～458、584～586、587～589、603～605位(見圖6)。

1.陰性對照；2.陽性對照；3.CDV YD株；4.DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL 1000)圖4 H基因RT-PCR擴增結(jié)果

圖5 CDV H基因核苷酸序列的系統(tǒng)進化樹

注：陰影部分為潛在N連接糖基化位點(N-X-S/T)；▼為Cys位點圖6 CDV 不同分離株H蛋白氨基酸序比對分析

3 討論

CDV對外界環(huán)境的抵抗力差，其脂質(zhì)囊膜結(jié)構(gòu)易被光、熱破壞，導(dǎo)致病毒滅活，使得病毒分離成功率較低[3]。因此，臨床組織病料采集時盡量處于低溫環(huán)境，采集后盡快低溫保存，這樣才能使病毒在接種細(xì)胞前不被滅活。另外，采樣的部位、時間、樣品處理、病程類型、病犬的抗CDV抗體水平等因素都對病毒的分離有一定的影響，但最主要的因素是分離CDV所選細(xì)胞是否敏感。Vero-SLAM細(xì)胞可以表達犬淋巴細(xì)胞信號活性分子(SLAM，CD150)，CDV感染細(xì)胞時通過識別SLAM進入細(xì)胞進行復(fù)制[11]，大大提高了CDV的感染效率，并且感染后的細(xì)胞會出現(xiàn)明顯的CPE，便于進行病毒分離和滴度測定。病料組織在接種Vero-SLAM細(xì)胞48 h后，出現(xiàn)了與CDV疫苗株相同的變化，如細(xì)胞溶解、胞漿空泡化、合胞體等CPE，測定分離病毒第1代細(xì)胞毒滴度為104.625TCID50/mL。分離的病毒不凝集豚鼠、豬、雞和人“O”型紅細(xì)胞，一方面說明該病毒無血凝性，另一方面說明該病毒材料不含CAV、CPV或者CPIV，通過間接免疫熒光檢測證明該病毒為CDV。通過RT-PCR鑒定可以擴增到419 bp的目的條帶，與CDV疫苗株一致。犬、水貂、狐貍接種分離毒株后5～7 d開始出現(xiàn)犬瘟熱癥狀，并可以監(jiān)測到感染動物排毒。對動物的致病性試驗也為不同動物的CDV攻毒模型的建立提供一定的參考。以上結(jié)果均符合犬瘟熱病毒特點[12]，證明分離的病毒是犬瘟熱病毒。

CDV主要分為7個基因型，Asia-1、Asia-2、Europe、Europe Wildlife、vaccine(America-1)、America-2、Arctic[12]，另外，近幾年一些地區(qū)出現(xiàn)了新的病毒譜系，預(yù)示著它們可能是新的基因型，例如Africa、Asia-3、Argentina和America[13-17]。H基因系統(tǒng)發(fā)生樹結(jié)果表明，CDV具有地理性分布現(xiàn)象，YD株與國內(nèi)的毒株同源性較高組成一個系，歐美和日本各成一個系。另外，其分布與宿主無關(guān)，進化樹中不同宿主來源的毒株均成隨機分布。這些結(jié)果與其他學(xué)者報道一致[18-19]。蛋白質(zhì)糖基化程度可能影響病毒的抗原性，CDV H蛋白潛在的N連接糖基化位點不同可能會破壞重要的中和相關(guān)表位位點[20-22]。目前最常用的疫苗株是Onderstepoort和Convac，兩者的N連接糖基化位點分別是6個和7個，而野毒株為8個或9個，其中309～311位(H蛋白位置)為野毒株特有。這些遺傳差異可能是近年來暴發(fā)犬瘟熱的重要原因[23]。YD株H蛋白中有9個潛在的N連接糖基化位點(N-X-S/T)，與國內(nèi)大多數(shù)野毒株相同，而第584～586位為國內(nèi)毒株所特有。CDV H蛋白中天冬氨酸(Cys)對該蛋白成熟過程的正確折疊是必要的[24]，YD株H蛋白中可見12個保守的Cys殘基，且所在位置均與其他毒株相同。

綜上所述，本試驗從病犬組織中成功分離到1株CDV強毒株；H基因測序分析顯示，該毒株屬于Asia-1型。研究結(jié)果為當(dāng)前中國CDV毒株變異情況提供了參考，為疫苗研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。