唐賽賽（通訊作者） 李寶燕 周玉明 程 林 王海鳳 許夢(mèng)婷 胡江波

（1.山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，山東 煙臺(tái) 264100；2.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 煙臺(tái) 264100）

隨著生活方式的改變，我國(guó)心肌梗死（myocardialinfarction，MI）發(fā)病率呈逐年升高，且有年輕化趨勢(shì)。目前已證實(shí)MI主要危險(xiǎn)因素包括：高血壓、血脂異常、糖尿病、吸煙、超重和肥胖、年齡、性別等[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)[2]，在一些個(gè)體中，常表現(xiàn)出明顯家族史，提示遺傳因素在誘發(fā)MI發(fā)揮重要作用，而基因多態(tài)性是決定這種遺傳性重要因素。因此，對(duì)某一疾病人群和正常對(duì)照人群進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）對(duì)比研究，可確定SNP位點(diǎn)與該疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系[3]，因而廣泛應(yīng)用于疾病遺傳易感性研究。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200nt，位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)或胞核內(nèi)功能性非編碼RNA分子。但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)真核細(xì)胞lncRNA表現(xiàn)出復(fù)雜調(diào)控機(jī)制，主要從表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多方面實(shí)現(xiàn)調(diào)控，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化等進(jìn)程[4]，并在心血管疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程起重要作用。lncRNA可從炎癥、凋亡、增殖、自噬等多方面影響動(dòng)脈粥樣硬化病理進(jìn)程。研究表明，lncRNAs基因多態(tài)性可影響自身空間結(jié)構(gòu)，改變lncRNAs表達(dá)及其調(diào)控的信號(hào)通路，而影響個(gè)體對(duì)疾病易感性。這都提示lncRNAs基因多態(tài)性可能與MI遺傳易感密切相關(guān)。研究也發(fā)現(xiàn)，lncRNAMIAT的SNPs與日本人群MI發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。有關(guān)MIAT影響MI遺傳易感的潛在分子機(jī)制有待深入挖掘。

位于染色體22q12.1的lncRNAMIAT（myocardialinfarctionassocia tedtranscript，MIAT）研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)MIAT可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖，進(jìn)而導(dǎo)致病理性血管生成[5]。研究發(fā)現(xiàn)ST段抬高性MI病人外周血MIAT表達(dá)水平與非ST段抬高性MI病人相比明顯降低，并且MIAT與CPK和TnT水平呈負(fù)相關(guān)，這提示MIAT可作為心臟早期損傷輔助診斷依據(jù)。研究表明MIAT多態(tài)位點(diǎn)rs230152A等位基因能顯著增加日本個(gè)體罹患MI風(fēng)險(xiǎn)。我們推測(cè)MIAT基因多態(tài)性在MI發(fā)生發(fā)展過(guò)程發(fā)揮重要作用，而本項(xiàng)目通過(guò)對(duì)MIAT基因中國(guó)漢族人群最小等位基因頻率大于20%的SNPs位點(diǎn)進(jìn)行分型，篩選出影響MI發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)SNPs位點(diǎn)，并探討這些多態(tài)位點(diǎn)影響MI遺傳易感的潛在分子機(jī)制。

一、資料與方法

SNP經(jīng)典思路步驟是先找目的基因標(biāo)簽SNPs，然后挑選功能位點(diǎn)，但HapMap網(wǎng)站關(guān)閉，很多選擇標(biāo)簽SNPs的方法不能使用，但還有千人基因組網(wǎng)站數(shù)據(jù)能用，本文將詳細(xì)敘述如何從千人基因組網(wǎng)站下載某個(gè)區(qū)段位點(diǎn)信息導(dǎo)入Haploview選擇標(biāo)簽SNPs。

1.獲取基因在染色體上的位置信息，以MIAT為例，打開(kāi)http：//grch37.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/Index，輸入基因MIAT，點(diǎn)擊Go后進(jìn)入MIAT基因信息界面，會(huì)出現(xiàn)MIAT在染色體上的位置。

2.將信息復(fù)制到VCFtoPEDConverter界面里，VCFtoPEDConverter是千人基因組網(wǎng)站自帶的將vcf轉(zhuǎn)換為HapMap格式在線工具，直接輸入基因位置信息可轉(zhuǎn)換。打開(kāi)網(wǎng)站找到VCFtoPEDConverter把頁(yè)面包括基因位置、中國(guó)漢族北京人群（CHB）等信息填寫完整。點(diǎn)擊run后等待刷新完畢，顯示done，點(diǎn)擊查看結(jié)果。下載ped和info文件，解壓兩個(gè)文件放入同一文件夾。

3.在Haploview里，打開(kāi)ped文件，info文件也可以自動(dòng)識(shí)別填入。如果提示morethantwoallelesatmarker86，去文件里找到錯(cuò)誤的位點(diǎn)，將其修改過(guò)來(lái)便可。結(jié)果177個(gè)位點(diǎn)可100%覆蓋這個(gè)基因，不需要這么多位點(diǎn)，Minimumminorallelefreq可設(shè)置0.05、0.1、0.2，本實(shí)驗(yàn)選0.20。點(diǎn)擊RescoreMarkers。一般r2＞0.8說(shuō)明兩個(gè)位點(diǎn)是高度連鎖，一個(gè)位點(diǎn)可以代表另外一個(gè)，點(diǎn)擊runtagger，得到13組（其中4個(gè)沒(méi)有和其他SNP高度連鎖）。最后根據(jù)位點(diǎn)在基因上的位置一般和最小等位基因頻率（MAF）大于20%選出合適的位點(diǎn)進(jìn)行分析。結(jié)合NCBI上SNP位點(diǎn)在染色體的位置，挑選出位于外顯子并且有轉(zhuǎn)錄本的SNP，結(jié)果如表2所示。

二、結(jié)果

1.染色體的位置，在千人基因組中查找到MIAT在染色體的位置是22：27042392-27072438，用于VCFtoPEDConverter。

2.MIAT的SNP，在Haploview里通過(guò)篩選獲得SNP，rs763271、rs35778551、rs1981493、rs36053931這四個(gè)沒(méi)有和其他SNP高度連鎖。MIAT中其他高度連鎖的SNP編號(hào)如表1所示。

表1 MIAT中其他高度連鎖的SNP編號(hào)（MAF＞20%）

3.進(jìn)一步篩選SNP，結(jié)合NCBI上SNP位點(diǎn)在染色體位置，挑選出位于外顯子并且有轉(zhuǎn)錄本的MAF大于20%SNP，最終確定MIAT5個(gè)SNP位點(diǎn)，結(jié)果如表2所示。

表2 篩選出MIAT的基因多態(tài)性（MAF＞20%）

結(jié)語(yǔ)

遺傳變異中最常見(jiàn)SNP，當(dāng)排除其他混雜因素后，一個(gè)遺傳標(biāo)記在病例組中的頻率高于對(duì)照組，即表明該遺傳標(biāo)記與疾病相關(guān)聯(lián)，根據(jù)MI危險(xiǎn)因素、病理機(jī)制和代謝通路等，從已知基因內(nèi)部和其5’和3’端選擇多個(gè)遺傳標(biāo)記作為研究對(duì)象，為進(jìn)一步研究SNP位點(diǎn)與MI發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)奠定基礎(chǔ)。本研究從MIAT基因177個(gè)SNP位點(diǎn)篩選出5個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)分別為rs5761670、rs4280、rs9625066、rs4274、rs5997112，通過(guò)此種方法大大節(jié)省人力物力，但篩選方法不僅拘泥于此，也可使用其他方法，并且更多功能有待發(fā)掘。