張彩霞 張玉欣 接琳琳

（1.山東中醫(yī)藥高等?？茖W校，山東 煙臺 204199；2.莒縣中醫(yī)醫(yī)院，山東 日照 276500）

大量研究表明，60歲以后隨著年齡的增長人的認知記憶能力逐漸衰退，主要表現(xiàn)為老年人進行性記憶功能、認知功能和行為功能等障礙，這都是老齡化的表現(xiàn)。而認知記憶能力衰退又進一步影響到老年人生活質(zhì)量與活動能力[1]。目前，改善老年人認知能力衰退多用中藥方劑調(diào)理，如補腎益智方、健腦益智湯、補陽還五湯等，通過保護海馬神經(jīng)元，而達到緩解的作用[2]。臨床研究表明，補腎益智方可通過改善小膠質(zhì)細胞介導的慢性炎癥反應(yīng)，從而改善阿爾茨海默病模型小鼠的學習記憶能力[5]，進而緩解老年遺忘型輕度認知功能障礙[3]。因此，本研究探討應(yīng)用補腎益智方對治療老年型記憶衰退的作用，為防治老年人記憶衰退開辟一條新途徑。

一、材料與方法

1.動物與分組

快速老化模型SAMP8小鼠 24只，3月齡，雄性，體質(zhì)量為20～25 g。購自北京華阜康生物科技有限公司，動物許可證號 SCXK（京）2019-0008。飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥高等?？茖W校動物實驗中心 SPF級動物實驗室，動物實驗室內(nèi)小鼠可自由飲水，通風良好，自然光照，室溫 （22±2）℃，明暗交替。適應(yīng)性喂養(yǎng)2周。

將 SAMP8小鼠隨機分為 3組，分別為模型組、補腎益智方中藥低劑量組和補腎益智方中藥高劑量組。模型組小鼠按體重給予生理鹽水灌胃，低劑量中藥組給予補腎益智方藥液2.68 g/（kg·d）進行灌胃，高劑量中藥組給予補腎益智方藥液5.36 g/（kg·d）進行灌胃，連續(xù)灌胃6周。

2.儀器與試劑

Morris水迷宮測試軟件和設(shè)備購于廣州飛迪生物科技有限公司。蘇木精-伊紅（haematoxylin-eosin，HE）染色液購于碧云天生物技術(shù)有限公司。

3.方法

3.1 補腎益智方的制備 補腎益智方組成：熟地黃15 g、枸杞子20 g、山茱萸12g、鹽益智仁6g、丹參15 g、當歸10g、生白術(shù)10g、郁金10g、石菖蒲10 g、川芎10 g、人參12 g、遠志6 g，以上藥物經(jīng)山東天江藥業(yè)制成免煎顆粒。補腎益智方劑量設(shè)定是根據(jù)成人的臨床給藥劑量 1.34 g/kg·d的2 倍、4倍確立，低劑量補腎益智方藥液終濃度為2.68 g/（kg·d）進行灌胃，高劑量補腎益智方藥液終濃度為5.36 g/（kg·d）。藥液配制完成后放置于 4℃冰箱冷藏備用，用前37℃溫水浴后搖勻。

3.2 Morris 水迷宮測試試驗 灌胃 42 d 后SAMP8小鼠可進行水迷宮適應(yīng)訓練。首先訓練小鼠站臺，將SAMP8小鼠置于平臺上 1 min后，進行入水訓練，小鼠由不同象限入水，1 min/次。每只SAMP8小鼠參與訓練 2 次。若小鼠在規(guī)定時間內(nèi)找不到站臺，人為引導到站臺，且停滯1 min。小鼠定位航行實驗共進行 5 d，將平臺轉(zhuǎn)移至第三象限中心，分別于上、下午各進行試驗1 次，試驗時間為1 min/次。調(diào)整第一象限的池壁中點作為入新的水點，上午和下午均以相同順序入水進行。若小鼠在60s內(nèi)未能找到平臺，人為將小鼠引導至平臺，且在平臺停滯 1 min，再將小鼠放回籠內(nèi)。以小鼠入水后的逃避潛伏期設(shè)為觀測指標，若小鼠在1min 內(nèi)不能找到平臺，記錄為60s。定位航行試驗結(jié)束后，次日上午撤除平臺，進行小鼠空間探索試驗。在第一象限入水，記錄游泳軌跡，測量小鼠逃避潛伏期數(shù)據(jù)收集并進行比較分析。

3.3 動物取材及 HE染色 SAMP8小鼠 Morris 水迷宮試驗完成后，模型組、補腎益智方高劑量組和補腎益智方低劑量組小鼠，烏拉坦麻醉后，4%多聚甲醛灌流固定，剝離小鼠大腦，將大腦置于預(yù)冷的4%多聚甲醛溶液，4℃固定過夜，脫水、透明、全腦修塊、浸蠟、包埋，常規(guī)制作石蠟切片，進行HE染色，攝片。

4.數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計分析軟件，按獨立樣本 t 檢驗進行顯著性檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

二、結(jié)果

1.補腎益智方對 SAMP8模型小鼠 Morris 水迷宮逃避潛伏期的影響

在Morris 水迷宮定位航行試驗中，隨著訓練次數(shù)的增加SAMP8模型小鼠的逃避潛伏期均呈下降趨勢（表1）。與模型組相比，補腎益智方組逃避潛伏期均明顯縮短。而高劑量組逃避潛伏期比低劑量組逃避潛伏期明顯縮短。

表1 各組小鼠定位航行實驗潛伏期用時比較（±s）

表1 各組小鼠定位航行實驗潛伏期用時比較（±s）

注：與模型組比較，△P＜0.05。

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2.補腎益智方對SAMP8模型小鼠腦組織病理形態(tài)的影響

模型組小鼠的海馬神經(jīng)元排列紊亂、疏松，細胞結(jié)構(gòu)不清晰。神經(jīng)元數(shù)目減少，體積縮小，細胞核固縮呈不規(guī)則形。與模型組相比，補腎益智方組神經(jīng)元排列緊密、整齊，輪廓相對清晰，未見核固縮等病理損傷。

三、討論

我國是世界上老年人口最多的國家，而且也是人口老齡化發(fā)展速度最快的國家之一[5]。隨著人口老齡化問題的日益加重，人們越來越多的關(guān)注于如何延緩衰老過程中記憶認知功能下降，促進記憶認知能力的發(fā)展，維持終生的腦健康。人類的老齡化過程會伴隨大腦的結(jié)構(gòu)和功能變化，從而導致老年人的反應(yīng)遲緩、工作和情節(jié)記憶以及執(zhí)行能力等記憶認知能力下降，而老年人的記憶認知損害又進一步影響到老年人日常生活質(zhì)量與活動能力。目前，改善老年人記憶衰退多用中藥方劑調(diào)理，如補腎益智方、健腦益智湯、補陽還五湯等，通過保護海馬神經(jīng)元，而達到緩解的作用。

補腎益智方是針對阿爾茨海默病腎精不足、氣血虧虛的病理而設(shè)計的組方，具有補腎填精、益髓健腦、益氣養(yǎng)血活血的功效[6]。研究表明補腎益智方能夠降低阿爾茨海默癥大鼠腦內(nèi)谷氨酸（Gu）和天冬氨酸（Asp）的含量，導致抑制性γ氨基丁酸（Y-GABA）和氨基酸甘氨酸（Gly）的含量升高，從而有預(yù)防及緩解阿爾茨海默病癥狀的功效[7]。實驗室水迷宮試驗也表明，補腎益智方能夠顯著提高大鼠學習記憶能力[8]。本研究利用快速老齡化SAMP8小鼠為模型，補腎益智方連續(xù)灌胃6周后，在 Morris 水迷宮試驗中發(fā)現(xiàn)模型組SAMP8小鼠有學習記憶功能受損的現(xiàn)象，而補腎益智方組小鼠的空間記憶學習功能有提高現(xiàn)象。表明補腎益智方能顯著提高SAMP8小鼠學習記憶能力，且補腎益智方高劑量效果優(yōu)于低劑量。通過HE染色觀察，發(fā)現(xiàn)補腎益智方組能夠減輕SAMP8小鼠腦組織病理變化，有良好的保護神經(jīng)元的作用。這可能與抗細胞凋亡機制有關(guān)。

綜上所述，本研究提示補腎益智方能改善老齡化引起的空間學習記憶認知障礙，表現(xiàn)為SAMP8模型小鼠行為學能力的提高及腦病理學變化，這可能與補腎益智方能夠調(diào)控神經(jīng)元凋亡機制密切相關(guān)。但是中藥方劑具有靶點多、途徑多的特點，中藥方劑對神經(jīng)元藥物的相關(guān)機制還有不明確，有待于進一步深入研究。