賀屹成，王夢姣，秦公偉

陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000

茶樹[Camellia sinensis (L.) O. Kuntze]是我國重要經(jīng)濟(jì)作物，茶葉產(chǎn)業(yè)成為各主產(chǎn)茶區(qū)的支柱產(chǎn)業(yè)和部分貧困地區(qū)農(nóng)民脫貧致富的重要產(chǎn)業(yè)。但在茶葉產(chǎn)業(yè)發(fā)展過程中，也出現(xiàn)了一些嚴(yán)重掣肘問題，如盲目使用化學(xué)肥料導(dǎo)致的茶園土壤土質(zhì)退化、高劑量化學(xué)農(nóng)藥施用導(dǎo)致茶葉農(nóng)藥殘留日益嚴(yán)重等。探索能顯著降低化學(xué)肥料與農(nóng)藥施用量的新技術(shù)、新方法成為促進(jìn)茶葉產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要研究課題。

茶樹根際土壤微環(huán)境的穩(wěn)定性是茶樹正常生長及茶葉品質(zhì)的保證[1]，土壤微生物的多樣性和穩(wěn)定性還能促進(jìn)惡劣土壤環(huán)境的生物修復(fù)[2]。 茶樹根際土壤細(xì)菌，作為茶樹根際土壤微環(huán)境中營養(yǎng)元素循環(huán)的重要驅(qū)動力，對土壤肥力和茶樹正常生長具有顯著促進(jìn)作用[3]。例如，某些根際促生菌能夠分泌生長素類物質(zhì)促進(jìn)植物生長[4]；某些具有較高固氮酶活性的菌株可以進(jìn)行生物固氮，提供植物生長必需的氮元素[5]和提高土壤氮素含量[6]；根際促生微生物的旺盛代謝可以促進(jìn)土壤有機(jī)物的分解和營養(yǎng)元素的礦化，改善土壤營養(yǎng)環(huán)境[7]，土壤營養(yǎng)元素的變化又會顯著影響土壤根際微生物的群落組成[8]，從而形成一個良性循環(huán)。不僅如此，許多根際微生物通過分泌Phenazines 及其衍生物、Tropolone 和Pyocyunim 等抑菌物質(zhì)[9-10]，達(dá)到預(yù)防和降低某些植物病害的效果。

試驗從根際微環(huán)境出發(fā)，采用高通量擴(kuò)增子測序法對茶樹根際細(xì)菌的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究，并結(jié)合茶樹根際土壤營養(yǎng)元素含量、pH 值及含水量，分析土壤環(huán)境因素與根際細(xì)菌多樣性的相互關(guān)系，以期為土壤改良和微生物菌肥開發(fā)提供理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 采樣方法、采樣地及茶樹概況

采樣點為秦巴山區(qū)的鎮(zhèn)巴、寧強(qiáng)和城固三地的典型茶園（表1）。選擇距離根系5 ～15 cm 的根周土壤，去除土壤表面異物后，取距離地表10 ～20 cm 深度的土壤樣品；每處茶園不同樹齡樣品均按 “S”形補(bǔ)點，取10 份土壤樣品[11]。收集土壤樣品后迅速帶回實驗室進(jìn)行充分混勻并過2 mm 篩，分裝、標(biāo)記后分別保存在4 ℃冰箱、-80 ℃冰箱。

表1 采樣信息表Table 1 Sampling Information

1.2 茶樹根際土壤理化指標(biāo)測定

茶樹根際土壤有機(jī)碳、總氮、總磷、全鉀、水解性氨、有效磷、速效鉀的含量測定分別參考森林土壤有機(jī)碳、氮、磷和鉀的測定方法[12-15]。 土壤含水量及土壤pH值測定參考喬帥等[16]方法。

1.3 茶樹根際土壤細(xì)菌多樣性分析

采用高通量測序法測定分析茶樹根際土壤細(xì)菌多樣性，DNA 提取、PCR 擴(kuò)增、產(chǎn)物電泳檢測及切膠純化、構(gòu)建DNA 庫、OTU 數(shù)據(jù)的獲取及測序過程以及OUT 序列注釋過程參考WANG 等[2]方法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

1.4.1 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建及多樣性分析

選取總體相對豐度排在前50 且有屬分類信息的OTU 代表性序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建參考Saitou[17]。

使用QIIME（V1.9.1） 軟件中的alpha_diversity. py 腳本對OTU 序列進(jìn)行分析，并計算α 多樣性指數(shù)（Chao1、Shannon 以及Simpson）。

利用非度量多維尺度法（Nonmetric Multi-Dimensional Scaling, NMDS）計算樣品的Weighted Unifrac 和Uweighted Unifrac 距離，分析其β 多樣性。

1.4.2 NMDS（Non-metric Multidimensional scaling） 分析

在beta 多 樣 性 距 離（Weighted Unifrac、Unweighted Unifrac）的計算基礎(chǔ)上，基于Weighted Unifrac 和Unweighted Unifrac 距離矩陣，使用QIIME 軟件和ggplot 2 軟件包進(jìn)行NMDS 分析并繪制出NMDS 圖。

1.4.3 茶樹根際理化指標(biāo)分析

茶樹根際土壤元素含量、酸堿度和含水量取3 次平行實驗平均值，用SPSS 和R 軟件，計算不同采樣地之間物理化學(xué)指標(biāo)的平均值、方差及其之間的差異性，p ＜ 0.01 表示組別之間差異性顯著，用小寫字母標(biāo)明。

1.4.4 相關(guān)性分析

RDA/CCA 分析：使用R 軟件對環(huán)境因子進(jìn)行DCA（Detrended correspondence analysis）分析，根據(jù)梯度值確定模型類型，并分析繪圖。

分別用SPSS（Statistical Product and Service Solutions）和R 軟件，進(jìn)行環(huán)境因子與高通量測序結(jié)果中細(xì)菌α 多樣性指數(shù)及相對豐度大于1%的門的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性

2.1.1 茶樹根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

高通量測序結(jié)果表明，三個茶園土樣中細(xì)菌分布在41 個門中，其中相對豐度大于1%的有13 個門（圖1A），變形菌門、酸桿菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢菌門。變形菌門所占百分比在鎮(zhèn)巴及城固土樣中隨茶樹樹齡增長先下降后增高，在寧強(qiáng)土樣中先升高后下降；酸桿菌門所占百分比在鎮(zhèn)巴及城固土樣中隨茶樹樹齡增長先上升后下降，在寧強(qiáng)土樣中則持續(xù)上升；擬桿菌門所占百分比在三個采樣地均隨茶樹樹齡增長而持續(xù)下降。

三個茶園茶樹根際細(xì)菌分布于1288 個屬中，其中相對豐度占比大于1%的屬有33 個（圖1B）。地桿菌屬（16.54%）為鎮(zhèn)巴2 年樹齡茶樹根際細(xì)菌的優(yōu)勢屬,代爾夫特氏屬（8.31%）為城固20 年以上樹齡茶樹根際細(xì)菌的優(yōu)勢屬。

選取所有采樣地不同樹齡根際土壤中總體相對豐度排在前50 且有屬分類信息的OUT 代表性序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1C），并將其相對豐度進(jìn)行可視化展示。結(jié)果表明，Delftia OTU3 是總體相對豐度最高的序列。

1 ～ 34 分別代表相對豐度小于1%及未鑒定種等的總和、Bryobacter、Solibacter、RB41、嗜酸棲熱菌屬、Parafrigoribacterium、Paeniglutamicibacter、 黃桿菌屬、地桿菌屬、芽孢八疊球菌屬、芽單胞菌屬、硝化螺菌屬、伯克氏菌屬、反硝化卡斯特蘭尼氏屬、代爾夫特氏屬、Massilia、Chujaibacter、 Rhodanobacter、寡養(yǎng)單胞菌屬、Udaeobacter、Chthoniobacter、Granulicella、Koribacter、Mucilaginibacter、HSB_OF53-F07、慢生根瘤菌屬、 貪嗜菌屬、Acidipila、Lysobacter、假單胞菌屬、 Haliangium、Pseudolabrys、Acidibacter、Terrimonas。

2.1.2 茶樹根際土壤細(xì)菌多樣性

土壤樣品中細(xì)菌α 多樣性指數(shù)結(jié)果（圖2A）表明，三個采樣地不同樹齡物種數(shù)量變化趨勢不完全一致，鎮(zhèn)巴采樣地10 年樹齡茶樹根際細(xì)菌數(shù)量最多；城固和寧強(qiáng)采樣地不同樹齡茶樹根際細(xì)菌數(shù)量有一定變化，但是變化不顯著。香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)結(jié)果表明（圖2B、圖2C），三個采樣地不同樹齡茶樹根際細(xì)菌多樣性變化不一致，鎮(zhèn)巴采樣地2 年樹齡茶樹根際細(xì)菌多樣性最差，城固采樣地10 年樹齡茶樹根際細(xì)菌多樣性最差，寧強(qiáng)采樣地20 年以上樹齡茶樹根際細(xì)菌多樣性最差。

采用NMDS 法對樣品的Beta 多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明（圖3），樹齡越大，樣品之間根際細(xì)菌群落多樣性差異越小，不同采樣地20 年以上樹齡茶樹根際樣品的細(xì)菌多樣性差異最小。

圖1 三地茶園茶樹根際土壤細(xì)菌群落組成分析Figure 1 Analysis of bacterial community composition in rhizosphere soil of tea trees in three tea gardens

圖2 三地茶園茶樹根際土壤細(xì)菌Alpha 多樣性分析 Figure 2 Analysis of α-bacterial diversity in rhizosphere soil of tea trees in three tea gardens

圖3 利用非度量多維尺度法三地茶園茶樹根際土壤細(xì)菌Beta 多樣性分析 Figure 3 Analysis of Beta-bacterial diversity in rhizosphere soil of tea trees in three tea gardens by nonmetric multidimensional scaling method

2.2 茶樹根際土壤理化性質(zhì)

茶樹根際土壤元素含量分析結(jié)果（圖4）表明，鎮(zhèn)巴和城固兩地茶樹根際土壤的有機(jī)碳、總氮、水解性氮、有效磷以及速效磷等元素含量都隨樹齡增加而呈現(xiàn)下降的趨勢，個別元素含量在20 年以上樹齡的茶樹根際土壤中略有上升（圖4A、圖4B、圖4E、圖4F、圖4G）。寧強(qiáng)采樣地10 年樹齡茶樹根際土壤中有機(jī)碳、總氮、水解性氮及有效磷等元素含量均為最高（圖4A、圖4B、圖4E、圖4G）；2 年樹齡茶樹根際土壤中總磷含量、有效磷含量及全鉀含量均為最高（圖4C、圖4D、圖4F）。

三地不同樹齡土壤樣品pH 值無顯著差異性（圖4H）。土壤含水量呈現(xiàn)出不同變化趨勢，含水量最高的分別是鎮(zhèn)巴采樣地10 年樹齡茶樹根際土壤、城固2 年樹齡茶樹根際土壤及寧強(qiáng)20 年以上樹齡茶樹根際土壤（圖4I）。

圖 4 茶樹根際土壤元素含量、pH 值及含水量（數(shù)據(jù)差異性標(biāo)注同圖1 和圖2）Figure 4 Analysis of element content, pH value and water content in rhizosphere soil of tea trees in three tea gardens

2.3 根際土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌多樣性的相關(guān)性

采用RDA/CCA 方法對土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌多樣性進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果（圖5）表明，對采樣地根際微生物多樣性影響最大的前四位環(huán)境因子分別為土壤總氮含量、pH 值、有機(jī)碳及水解性氮。

對環(huán)境因子與細(xì)菌多樣性指數(shù)及13 個主要細(xì)菌門相關(guān)性分析結(jié)果表明，有機(jī)碳、總氮和水解氮與chao1 和shaanon 指數(shù)呈極顯著或顯著負(fù)相關(guān)，但是對simpson 指數(shù)相關(guān)性不顯著；土壤pH 值與simpson 指數(shù)顯著相關(guān)（表2）。有機(jī)碳、總氮、水解性氮、速效鉀含量與各細(xì)菌門相關(guān)性顯著或極顯著，其余環(huán)境因子與細(xì)菌門的顯著或極顯著相關(guān)數(shù)量均遠(yuǎn)小于50%；醋酸桿菌門、放線菌門、Patescibacteria 的相對豐度受到環(huán)境因子影響大（表3）。

圖5 RDA/CCA 法分析細(xì)菌多樣性與環(huán)境因子關(guān)系Figure 5 Relationship between bacterial diversity and environmental factors analyzed by RDA/CCA method

表2 環(huán)境因子與根際土壤細(xì)菌α 多樣性指數(shù)相關(guān)性Table 2 Correlation between environmental factors and Alpha diversity index of rhizosphere soil bacteria

表3 環(huán)境因子與根際土壤細(xì)菌門的相關(guān)性Table 3 Correlation between environmental factors and microbial phylum in rhizosphere soil

3 結(jié)論與討論

本研究采用高通量測序法對秦巴山區(qū)鎮(zhèn)巴、寧強(qiáng)和城固三地的典型茶園中不同樹齡根際土壤細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析，共檢測到13 個主要的細(xì)菌門（門的相對豐度大于1%），這些主要細(xì)菌門在每個采樣地分布總豐度范圍為80.25%～98.95%；變形菌門、酸桿菌門以及擬桿菌門為優(yōu)勢菌門。這一結(jié)果與前人研究[18]相比，分離得到的門的種類多，優(yōu)勢菌門占比低，充分反映了樣地茶樹根際土壤細(xì)菌多樣性較為豐度。伯克氏菌、慢生根瘤菌、Chthoniobacter, Flavobacterium, Gemmatimonas, Massilia 以及 RB41 都是常見的根際促生菌[19]，這些菌都能在本研究中找到，說明本研究樣品采集地具有開發(fā)根際促生微生物的可能性。

不同樹齡茶樹根際土壤細(xì)菌多樣性變化趨勢表明，鎮(zhèn)巴2 年生樹齡茶樹根際土壤細(xì)菌豐富度最低，城固則為10 年樹齡、寧強(qiáng)20 年樹齡的茶樹根際土壤細(xì)菌豐度最低。值得注意的是，雖然不同采樣地細(xì)菌豐富度指數(shù)變化趨勢不一致，但是除去組中豐富度最低的樹齡，本組中剩余兩個年份樹齡茶樹根際細(xì)菌豐富度變化不顯著。因此，一方面可以得出，以上變化趨勢可能和采樣地細(xì)菌數(shù)量有一定關(guān)聯(lián)；另一方面也說明，受到細(xì)菌數(shù)量的影響，在判斷具體哪個采樣地、哪個樹齡茶樹根際細(xì)菌多樣性豐度最佳，還需繼續(xù)深入研究。

對樣品的Beta 多樣性分析結(jié)果表明，樹齡越長，茶樹根際土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)組成越相似。但是不同地區(qū)不同樹齡的根際土壤細(xì)菌多樣性變化不完全一致，這可能是不同地區(qū)根際土壤性質(zhì)有一定差別，如營養(yǎng)元素含量、膠體結(jié)構(gòu)、土壤性質(zhì)、土壤顆粒度等，對細(xì)菌多樣性有一定影響[20]。因長期施肥和茶樹根部有機(jī)酸的分泌，樹齡較大的茶樹根際土壤會出現(xiàn)明顯的土壤酸化、板結(jié)、正常土壤團(tuán)粒被破壞等現(xiàn)象，導(dǎo)致茶樹根系延展困難，吸收功能降低，茶樹長勢逐漸減弱，分泌物逐漸降低，與根際微生物互作顯著下降[21]。細(xì)菌是土壤微生物，尤其是根際微生物中的主要種群，但是大多數(shù)細(xì)菌的最適酸堿度是中性或中性偏堿性，酸性土壤也不適合大部分細(xì)菌生存。綜合分析，本研究認(rèn)為，在進(jìn)行后續(xù)秦巴山區(qū)典型茶樹根際土壤微環(huán)境與茶樹互作，尤其是根際土壤細(xì)菌多樣性與茶樹的相互關(guān)系研究中，建議將10 年樹齡茶樹根際土壤作為研究對象。

本研究對土壤環(huán)境因子與茶樹根際微生物的相關(guān)性研究結(jié)果表明，土壤有機(jī)碳含量、總氮含量、水解性氮含量能夠顯著影響茶樹根際土壤細(xì)菌多樣性，pH 值與速效鉀與茶樹根際土壤細(xì)菌多樣性有一定影響，與O'Brien 和Pasternak 的結(jié)果較為一致[22-23]。