王金坤 袁麗萍 李歡 肖紅云

1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬阜陽醫(yī)院（安徽阜陽236000）；2安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（合肥230022）

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）與慢性胃炎及消化性潰瘍、胃癌、胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤、胃食管反流病、功能性消化不良的發(fā)病機制密切相關(guān)已被公認(rèn)［1］。Hp感染在兒童中非常常見，近年來有越來越多的病例被報道［2］。正常情況下，Hp在pH ＜4 的酸性環(huán)境下無法存活。研究發(fā)現(xiàn)，感染了Hp的患兒其胃內(nèi)的pH 值比沒有感染的患兒高［3］。

酸敏感離子通道（acid-sensing ion channels，ASICs）是細(xì)胞外酸化激活的離子通道，屬于上皮鈉通道ENaC（epithelial sodium channels）∕退化因子基因DEG（degenerin）家族，在神經(jīng)組織中高表達(dá)［4］。ASICs 與細(xì)胞外H+的變化密切相關(guān)，在正常和病理條件下都能精確地感受到pH 值的變化［5］。本研究探討了胃黏膜ASICs 的表達(dá)及其在Hp感染患者胃腸功能中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取30 例主訴反復(fù)腹痛、惡心、嘔吐于2017年5月至2018年12月在我院兒科進行上消化道內(nèi)鏡檢查的30 例住院患兒為研究對象。本研究納入22 例經(jīng)內(nèi)鏡檢查診斷為胃炎的患者，分為Hp陽性組（n= 11）和陰性組（n= 11）。采用快速脲酶或C13 呼氣試驗來明確Hp感染。如果其中一項測試結(jié)果呈陽性，則被認(rèn)為是Hp感染。22 例患者均取胃竇黏膜活檢標(biāo)本，用甲醛固定。所有患兒內(nèi)鏡檢查前均無服藥史。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并取得患兒父母書面知情同意。

1.2 免疫組化法檢測胃竇黏膜ASIC1a、ASIC2 和ASIC3 表達(dá)按照免疫組化試劑盒說明書對胃炎患兒胃黏膜ASIC1a、ASIC2、ASIC3表達(dá)進行評估［6］。以上皮細(xì)胞胞漿呈棕黃色染色為陽性細(xì)胞，取每張切片的3 個視野在400 倍顯微鏡下觀察并計算免疫組化分?jǐn)?shù)。免疫組化分?jǐn)?shù)=陽性細(xì)胞平均光密度值×染色陽性的黏膜面積∕總黏膜面積。

1.3 ELISA 方法測定血清中CCK、SP、GAS 和MTL 水平住院患兒于次日上午8 ～10 時采血，1 300 ×g離心10 min，分離血清-80 ℃保存待測。按照ELISA 試劑盒說明書測定血清中CCK、SP、GAS 和MTL 水平，用ng∕mL 表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法血清CCK、SP、GAS 和MTL 以及胃黏膜ASICs 表達(dá)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用Pearson 相關(guān)性分析ASIC3表達(dá)與血清胃腸激素的相關(guān)性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況分析22 例胃炎患兒，男14 例，女8 例，年齡6 ～14 歲，平均（10.32 ± 2.18）歲。Hp陽性組男7 例，女4 例，年齡（10.72 ± 2.18）歲；Hp陰性組男7 例，女4 例，年齡（9.91±2.11）歲。兩組間性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 胃竇黏膜組織中ASIC1a、ASIC2 和ASIC3 表達(dá)ASIC1a、ASIC2 和ASIC3 陽性細(xì)胞主要分布在胃炎患兒胃黏膜的內(nèi)膜上皮和腺管中，在細(xì)胞膜內(nèi)可見褐色或黃色表達(dá)顆粒。在所有胃炎患兒胃黏膜中可見散在、稀疏的ASIC1a 和ASIC2 表達(dá)的陽性細(xì)胞（圖1B-C、E-F）。然而，Hp（+）患兒胃黏膜中ASIC3 表達(dá)陽性細(xì)胞較多，而Hp（-）患兒胃黏膜中ASIC3 表達(dá)陽性細(xì)胞較少（圖1A，D）。此外，ASIC1a、ASIC2、ASIC3 表達(dá)半定量證實胃竇黏膜ASIC3 蛋白表達(dá)在Hp感染與非Hp感染患者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

圖1 免疫組化法檢測胃炎患兒胃竇黏膜ASIC1a，ASIC2 和ASIC3 表達(dá)（×400）Fig.1 Expression of ASIC1a，ASIC2 and ASIC3 in gastric antrum mucosa of children with gastritis detected by immunohistochemistry（×400）

2.3 血清中CCK、SP、GAS 和MTL 水平Hp（+）組患兒血清CCK 和SP 水平明顯高于Hp（-）組患兒（圖2A-B）。Hp（+）組患兒血清MTL 水平明顯高于Hp（-）組患兒（圖2D）。但Hp（+）與Hp（-）組患兒血清GAS 水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖2C）。

表1 胃炎患兒胃竇黏膜ASIC1a、ASIC2 和ASIC3 表達(dá)分析Tab.1 Expression analysis of ASIC1a，ASIC2 and ASIC3 in gastric antrum mucosa of children with gastritis±s

表1 胃炎患兒胃竇黏膜ASIC1a、ASIC2 和ASIC3 表達(dá)分析Tab.1 Expression analysis of ASIC1a，ASIC2 and ASIC3 in gastric antrum mucosa of children with gastritis±s

注：與Hp（-）組比較，**P ＜0.01

免疫組化分?jǐn)?shù)（%）組別Hp（+）組Hp（-）組例數(shù)11 11 ASIC1a 0.138±0.042 0.129±0.044 ASIC2 0.202±0.049 0.185±0.039 ASIC3 0.304±0.028**0.230±0.030

2.4 ASIC3 表達(dá)與血清CCK、SP、GAS、MTL 水平的關(guān)系分析ASIC3與血清胃腸激素的關(guān)系結(jié)果表明，ASIC3 的表達(dá)與血清CCK、SP 和MTL 的分泌有顯著相關(guān)性（R= 0.539，P= 0.01；R= 0.516，P=0.014；R=0.495，P=0.019），見圖3。

3 討論

圖2 ELISA 法測定血清CCK、SP、GAS 和MTL 水平Fig.2 Serum levels of CCK，SP，GAS and MTL were determined by ELISA

ASICs 屬于DEG∕ENaC 家族成員，是一種由細(xì)胞外酸激活的陽離子通道。ASICs 已被證實參與多種生理病理過程，如腫瘤、炎癥、缺血損傷、胃腸道疾病等［7-9］。有實驗研究表明，ASIC3 在胃炎和消化性潰瘍的情況下可促進胃酸過敏和疼痛，也參與結(jié)腸過敏［10］。

Hp感染是兒童慢性胃炎的病因之一［1］。正常兒童胃液pH 值＜4.0，可以抑制大部分細(xì)菌的生長，在胃內(nèi)形成相對無菌的環(huán)境［11］。然而，Hp可以通過激活存在人胃中的一種細(xì)胞質(zhì)脲酶，這種酶將尿素分解為CO2和NH3，從而增加胃腔的局部pH 值［12］。此外，日本男性患者的研究顯示，Hp對酸性分泌有較強的抑制作用［13］。PARK 等［14］報道，Hp感染兒童的pH（pH ＞4）高于胃正常pH（pH ＜4）。ASIC3 對細(xì)胞外pH 最敏感，其激活閾值為pH 7.2左右［15］。本研究發(fā)現(xiàn)感染Hp的胃炎患兒胃黏膜中ASIC3 的表達(dá)較未感染Hp的患兒顯著增加，而ASIC1a 和ASIC2 的表達(dá)卻沒有增加，提示胃內(nèi)Hp可上調(diào)胃黏膜ASIC3 的表達(dá)。

據(jù)報道，ASICs 與功能性胃腸疾病相關(guān)［10］。本研究測定了CCK、SP、GAS 和MTL 胃腸激素水平來探討ASICs 與胃腸功能的關(guān)系。CCK 能刺激膽囊收縮和胰腺分泌，促進腸道運動，抑制幽門括約肌收縮；對餐后胃運動有抑制作用，對胃排空有延緩作用［16］。SP 是存在于胃腸道系統(tǒng)肌腸和黏膜下神經(jīng)叢的一種神經(jīng)肽，實驗研究表明，SP 在胃腸道中發(fā)揮肌肉收縮、上皮離子轉(zhuǎn)運、血管通透性和免疫功能調(diào)節(jié)等作用［17］。本研究表明，與未感染Hp的患兒相比，Hp感染的患兒血清CCK 和SP 水平顯著升高。此外，CCK 和SP 的釋放與胃炎患兒胃黏膜ASIC3 的表達(dá)密切相關(guān)。

圖3 ASIC3 表達(dá)與血清CCK、SP、MTL 水平的相關(guān)性Fig.3 Correlation between ASIC3 expression and serum CCK，SP and MTL levels

胃泌素由胃竇及十二指腸近端黏膜G 細(xì)胞分泌，可促進胃酸分泌、胃竇收縮及胃腸黏膜再生。由Mo 細(xì)胞分泌的MTL 可促進上消化道機械運動和生理機電活性［18］。本研究表明，Hp感染的患兒血清MTL 水平明顯高于未感染Hp患兒。MTL 的釋放與兒童胃炎胃黏膜ASIC3的表達(dá)顯著相關(guān)。

綜上，Hp感染可誘導(dǎo)患兒胃黏膜ASICs，特別是ASIC3 的表達(dá)，ASIC3 參與胃腸道的病理生理功能。