董燕婕，王磊，鄔元娟，范麗霞，趙善倉，王文博

（山東省農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所/山東省食品質量與安全檢測技術重點實驗室，山東 濟南 250100）

近年來，隨著復合農藥的大量使用和輪換用藥日漸普及，農藥殘留現(xiàn)象比較突出［1］。農藥殘留不僅顯現(xiàn)在農產品上，土壤和水環(huán)境中也有報道。歐洲食品安全風險監(jiān)測結果顯示，30%的樣品含有多種農藥殘留，且最高含有10種以上［2］。Hvězdová等［3］對歐洲中部75個耕地土壤中的53種農藥和15種轉化物進行了檢測，發(fā)現(xiàn)51%的土壤檢出不低于5種農藥。在水生態(tài)環(huán)境中，農藥往往以復合污染物的形式存在，多種農藥經常共存于水體中［4］。多種農藥組分聯(lián)合毒性效應可能為協(xié)同效應、拮抗效應等，這種聯(lián)合毒性效應的不確定性對農藥的風險評價構成潛在威脅［5］。我國在制定農產品農藥殘留限量標準時一般僅考慮單一農藥的風險，在各類監(jiān)測項目中對不合格產品的判定也是以某一種農藥是否超標作為標準，尚未考慮多種農藥同時殘留的情況。由于農產品中單個農藥的殘留水平較低，其能夠引起的毒性效應也較低，但在實際聯(lián)合暴露情形下則可能引起較為明顯的聯(lián)合毒性效應。

基于近幾年國家食品及農產品質量安全風險監(jiān)測和風險評估數據，選取毒死蜱、克百威和聯(lián)苯菊酯為主要研究對象。毒死蜱主要通過多種作用機制引起肝功能障礙、遺傳毒性、神經行為和神經化學變化；主要毒性是由于抑制乙酰膽堿酯酶（AChE）而引起的神經毒性［6］?？税偻拘暂^高，急性暴露可抑制體內膽堿酯酶活性，導致流淚、流涎、瞳孔縮小、痙攣等，同時還具有生殖毒性、發(fā)育毒性、基因毒性、神經毒性等［7］。聯(lián)苯菊酯為擬除蟲菊酯類農藥，是一種神經毒劑，通過干擾離子通道、損傷神經系統(tǒng)，從而產生興奮性神經毒性，出現(xiàn)神經中毒癥狀［8］。為評估上述3種農藥是否影響人類神經系統(tǒng)結構或功能，使用已知具有高表達水平的神經元型nAChRs的人神經母瘤細胞SH-SY5Y［9］，研究3種農藥單獨和聯(lián)合作用SH-SY5Y細胞后的細胞毒性、凋亡率、活性氧水平、非酶和酶促抗氧化劑水平等指標，對3種農藥的聯(lián)合毒性作用進行評價，以期探明農藥殘留混合物的聯(lián)合毒性效應，為食品安全及人體健康風險評估和標準制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人神經母瘤細胞SH-SY5Y（本實驗室保存）；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購自Gibco公司；CCK-8試劑盒、活性氧檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒均購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；SOD檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒、GSH檢測試劑盒、克百威（CAS：1563-66-2，純度≥98.8%）、毒死蜱（CAS：2921-88-2，純度≥99.1%）、聯(lián)苯菊酯（CAS：82657-04-3，純度≥98.5%）標準品均購自北京壇墨質檢股份有限公司。

超凈工作臺（中國蘇州凈化SW -CJ-1FD）；CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO XD-101）；熒光倒置顯微鏡（日本OLYMPUS IX51）；臺式低速離心機（中國上海醫(yī)療器械股份有限公司）；流式細胞儀（美國Becton-Dickinson FACSCalibur）。

1.2 細胞培養(yǎng)與染毒

SH-SY5Y細胞用含10%胎牛血清、1.0%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃、質量分數5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數生長期。將3種農藥原藥用二甲基亞砜（DMSO）溶解，配成100 mmol/L的標準儲備液，-20℃儲存，試驗時用無血清培養(yǎng)基稀釋至待測濃度。

1.3 細胞毒性檢測

1.3.1 細胞存活率檢測 采用CCK-8法測定3種農藥單獨及混合對SH-SY5Y細胞活性的影響［10］。調整對數期細胞密度為5×104個/mL，每孔100μL接種于96孔板中孵育24 h后，棄去培養(yǎng)液，加入含不同濃度克百威、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯農藥及其組合的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h，克百威、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯及其聯(lián)合組終濃度分別為0.01、0.1、0.5、1、10、100、1 000μg/mL，聯(lián)合組的克百威、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯比例為1∶1∶1。每孔中加入10μL CCK-8試劑，繼續(xù)孵育2 h，用酶標儀測定其在450 nm下的吸收值。

1.3.2 細胞凋亡率檢測 采用Annexin V-FITC法測定3種農藥單獨及混合對SH-SY5Y凋亡率的影響［11］。將對數生長期的細胞消化接種到六孔板中，次日待細胞貼壁后，分別加入濃度為10 μg/mL克百威、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯及其組合，聯(lián)合組克百威、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯比例為1∶1∶1，對照組不添加農藥，培養(yǎng)48 h。用0.25%胰酶（不含EDTA）消化收集細胞；用PBS洗滌2次（1 000 r/min離心5 min），收集并調整細胞濃度為5×105個/mL；加入500μL的Binding Buffer懸浮細胞；加入5μL Annexin V-FITC混勻后，加入5μL Propidium Iodide，混勻；室溫、避光反應5～15 min；用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.3.3 細胞內活性氧（ROS）含量 采用DCFH-DA熒光探針法檢測細胞內活性氧含量［12］。將對數生長期的細胞消化接種到六孔板中，次日待細胞貼壁后，分別加入濃度為10μg/mL克百威、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯及其組合，聯(lián)合組克百威、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯比例為1∶1∶1，對照組不添加農藥，培養(yǎng)48 h。用PBS洗滌細胞一次（1 000 r/min離心5 min），收集并調整細胞濃度為1×106個/mL；按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10μmol/L，將收集后的細胞懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，37℃細胞培養(yǎng)箱內孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一次，使探針和細胞充分接觸；用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA；用流式細胞儀檢測（Ex=488 nm；Em=530 nm）細胞內活性氧情況。

1.3.4 細胞氧化應激指標測定 將對數生長期的細胞消化接種到六孔板中，次日待細胞貼壁后，分別加入濃度為10μg/mL克百威、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯及其組合，聯(lián)合組克百威、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯比例為1∶1∶1，對照組不添加農藥，培養(yǎng)48 h。小心吸取各組細胞0.1 mL進行測定。超氧化物歧化酶（SOD）、脂質過氧化產物丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）活性均按照試劑盒說明進行［13，14］。采用酶聯(lián)免疫檢測儀分別在550 nm和532 nm波長下測得其吸光度。

1.4 數據處理與分析

農藥間的相互作用類型采用Chou-Talaly數學模型［15］分析獲得?；旌衔锏穆?lián)合毒性類型采用CompuSyn（Compusyn Inc.，USA）［16］軟件進行分析。CI＞1表示拮抗作用；CI=1表示加和作用；CI＜1表示協(xié)同作用。使用SPSS軟件分析并處理數據，結果以平均值±標準差表示。通過Microsoft Excel軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 克百威、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯對SH-SY5Y細胞存活率的影響

由圖1可知，暴露24 h，不同濃度克百威、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯對SH-SY5Y細胞增殖的抑制率均低于20%，但具有濃度依賴性；暴露48 h，毒死蜱、克百威、聯(lián)苯菊酯最高濃度處理對細胞增殖的抑制率分別為25.67%、20.98%和18.50%，均具有濃度依賴性。與單獨處理相比，聯(lián)合處理組對SH-SY5Y細胞增殖的抑制率極顯著增加（P＜0.01）。由圖2可知，3種農藥在不同效應水平下均為協(xié)同效應（CI＜1），隨著濃度的增加，CI值逐漸減小，說明協(xié)同作用逐漸增強，在效應10%水平下，3種農藥呈極強的協(xié)同作用。

圖1 3種農藥單獨和聯(lián)合對SH-SY5Y細胞的抑制率

2.2 克百威、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯對SH-SY5Y細胞凋亡率的影響

圖2 48 h三種農藥的聯(lián)合指數

圖3 雙染法流式細胞術檢測圖

等濃度的毒死蜱、克百威、聯(lián)苯菊酯處理SHSY5Y細胞48 h后，與對照組相比，均能引起細胞產生顯著的凋亡現(xiàn)象（P＜0.05，圖3）。如表1所示，克百威處理組的細胞凋亡率為11.46%；聯(lián)苯菊酯處理組的細胞凋亡率為10.66%；毒死蜱處理組的細胞凋亡率為10.06%。三者混合作用于SHSY5Y細胞后引起的凋亡率上升到38.04%。

表1 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率

2.3 克百威、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯對SH-SY5Y細胞ROS的影響

與對照組相比，克百威、聯(lián)苯菊酯、毒死蜱處理后均使SH-SY5Y細胞產生過量ROS（P＜0.05）；3種農藥處理之間無顯著性差異，表明3種農藥均可以誘導SH-SY5Y細胞產生氧化應激。聯(lián)合組與單獨組相比，產生ROS的水平極顯著（P＜0.01）提升（圖4）。

2.4 克百威、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯對SH-SY5Y細胞抗氧化水平的影響

通過檢測3種農藥單獨和聯(lián)合處理SH-SY5Y細胞的SOD、GSH和MDA活性，判斷其對細胞抗氧化水平的影響（圖5）。與對照組相比，暴露于限量濃度的3種農藥后SH-SY5Y細胞內SOD和GSH活性均顯著下降（P＜0.05），MDA活性顯著提高；3個農藥處理組間差異不顯著。該結果表明3種試驗農藥均可以引起細胞抗氧化功能的顯著下降，進一步驗證了這些農藥可能通過誘導氧化應激對SHSY5Y細胞產生毒性。與單獨處理相比，聯(lián)合組極顯著降低GSH和SOD活性，提高MDA活性。說明3種農藥聯(lián)合對細胞誘導產生氧化應激的程度高于單獨處理。

圖4 3種農藥對SH-SY5Y細胞產生ROS的影響

圖5 3種農藥對SH-SY5Y細胞中SOD、MDA、GSH活性的影響

3 討論與結論

我國是農藥生產和使用大國，農藥的普遍使用尤其是復配農藥的興起，使多種農藥殘留的現(xiàn)象比較突出。岳暉等［17］對山東省市售蔬菜進行監(jiān)測表明，18.7%的產品（322批次）含兩種微量農藥殘留，15.4%（265批次）的產品存在3種及以上微量農藥殘留。多種農藥在無損害作用水平下混合可產生復雜的聯(lián)合效應，從而引起機體氧化應激、肝腎功能障礙［18］。即使是微量水平下的多農藥殘留毒性也可能是數倍或是數十倍地高于單體農藥殘留毒性［19］。因此本試驗選取蔬菜中檢出較多但超標率不高的3種農藥，采用SH-SY5Y細胞作為體外模型，研究其單獨和聯(lián)合作用對細胞存活率的影響。結果表明，3種農藥單獨作用于細胞均降低其存活率，在培養(yǎng)24 h和48 h后均具有濃度依賴性。Wang等［20］在體外用不同濃度的氯化鎘和毒死蜱（50、100 mmol/L）以及其組合處理SD大鼠脾淋巴細胞，發(fā)現(xiàn)毒死蜱對脾淋巴細胞增殖有顯著抑制作用?？税偻投舅莉鐚θ烁渭毎鸏-O2的增殖有抑制效果［21］。本試驗表明3種農藥聯(lián)合作用于細胞時，其毒性高于單獨處理；不同毒性效應水平下均為協(xié)同作用，隨著毒性效應水平的增加，CI值逐漸降低，協(xié)同效應逐漸增強。這說明雖然農產品中單獨農藥殘留量低于國家限量值，但多種農藥同時存在引發(fā)的強協(xié)同作用可能導致毒性呈數倍甚至數十倍的增大。

細胞凋亡是指在一定的病理或生理條件下，細胞自發(fā)地遵循自身程序，并由相關基因調控而呈現(xiàn)出的一種自主有序的死亡過程。本試驗研究了3種農藥單獨和聯(lián)合對細胞凋亡的誘導作用，結果表明單獨農藥處理可顯著引發(fā)細胞凋亡，且聯(lián)合作用細胞的凋亡率顯著高于單獨農藥。

為研究毒性、凋亡與氧化損傷之間的關系，本研究測定了暴露于各農藥的SH-SY5Y細胞內ROS水平和GSH、SOD及MDA活性，結果表明無論單獨還是聯(lián)合處理，3種農藥均顯著改變細胞的氧化還原因子水平，且聯(lián)合作用組的ROS含量顯著高于單獨處理組；3種農藥均顯著降低SOD和GSH活性，增加MDA活性。說明農藥通過產生過量ROS和抑制抗氧化系統(tǒng)誘導SH-SY5Y細胞產生氧化應激，證實氧化應激是農藥在SH-SY5Y細胞內引起毒性的機制之一。這與前人研究結果［22，23］類似。

綜上所述，各農藥單劑和組合可以抑制細胞增殖，顯著誘導SH-SY5Y細胞產生氧化應激，并發(fā)生凋亡，但是混合農藥誘導凋亡的作用機制尚不清楚，需要進一步通過細胞體外試驗和動物體內試驗探究其凋亡靶點和通路，為評估農藥多殘留聯(lián)合毒性機制提供科學依據。