金冠欽，孫 黎，夏玲紅，林厚文

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院藥學(xué)部，上海200127

肌苷是一種核苷，可由次黃嘌呤通過(guò)β-N9 糖苷鍵與核糖環(huán)（也稱為呋喃核糖）連接形成。作為ATP、輔酶A、RNA 及DNA 等物質(zhì)的組成部分之一，肌苷在人體的物質(zhì)代謝及能量代謝過(guò)程中起關(guān)鍵作用。在嘌呤從頭合成過(guò)程中，肌苷是腺苷酸和鳥(niǎo)苷酸的前體，通常存在于轉(zhuǎn)移RNA（transfer RNA，tRNA）中。肌苷能直接通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入體細(xì)胞，在核酸代謝、能量代謝和蛋白質(zhì)合成中發(fā)揮作用。目前的研究［1］發(fā)現(xiàn)，嘌呤和嘧啶代謝有關(guān)的遺傳性疾病有多種臨床表現(xiàn)，包括貧血、腎結(jié)石、免疫缺陷、抽搐、智力低下、自閉癥和生長(zhǎng)遲緩。急性心肌缺血患者血液中ATP 分解代謝產(chǎn)物的水平會(huì)升高，因此測(cè)定肌苷可以幫助對(duì)這一疾病的診斷［2-3］。肌苷作為輔酶類藥物，收錄于2020版《中國(guó)藥典》，用于白細(xì)胞減少癥、血小板減少癥、急性及慢性肝炎以及肝硬化等疾病的輔助治療。近年來(lái)，肌酐越來(lái)越多的藥理作用逐步被發(fā)現(xiàn)，包括修復(fù)外周組織損傷［4］及腦損傷［5-8］、抗抑郁［9］等。該藥在保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面［10］也具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。

肌苷的測(cè)定在醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。關(guān)于動(dòng)物血清［11-13］或血漿［14］中的肌苷的檢測(cè)方法國(guó)內(nèi)外均已有報(bào)道。近年來(lái)，質(zhì)譜檢測(cè)也越來(lái)越多地運(yùn)用于核苷和核苷酸類似物的定量分析［15-18］。但目前為止，這些方法均費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且缺乏專門的檢測(cè)系統(tǒng)。本文建立了一種簡(jiǎn)便、快速、選擇性高的固相萃取聯(lián)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（solid-phase extraction-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry， SPE-LC-MS/MS）測(cè)定血漿中肌苷濃度的方法，并對(duì)2 名健康志愿者12 h血漿中的肌苷濃度進(jìn)行了測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料

三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀及Analyst 1.5.1 數(shù)據(jù)分析軟件（3200QTrap，美國(guó)AB Sciex 公司），高效液相色譜儀（LC-20AD，日本Shimadzu 公司），電子分析天平（AE240，美國(guó)Mettler-Toledo 公司），高速冷凍離心機(jī)（Avanti30，美國(guó)Beckman公司），渦旋混合器（XW-80A，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠），-70 ℃超低溫冰箱（MDF-382E，日本Sanyo 公司），SPE 裝置（Vac Elut SPS 24，美國(guó)Varian 公司），OasisTMHLB Cartridge SPE 小柱（美國(guó)Waters公司），微孔濾膜（0.22 μm，上海半島實(shí)業(yè)有限公司），Milli-Q超純水處理系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑

肌苷對(duì)照品（純度99.1%，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)140669-201104），內(nèi)標(biāo)物拉米夫定（純度99.7%，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)101007-200701）。甲醇、磷酸、氨水、乙酸均為質(zhì)譜純，均購(gòu)自美國(guó)Merck公司；實(shí)驗(yàn)用超純水（電阻率18.2 MΩ·cm） 由Milli-Q 純水儀制備。

1.3 研究對(duì)象

本研究所使用的血漿樣本來(lái)源于6 名健康志愿者（24～30歲）。生物樣本采集均已通過(guò)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)的倫理審批。志愿者對(duì)研究?jī)?nèi)容知情同意并簽署知情同意書(shū)。最終納入2名志愿者，分別在0、3、8、10 h 采血，15 min 后清淡飲食。血漿樣本采集后儲(chǔ)存于-70 ℃冰箱，實(shí)驗(yàn)前置于室溫解凍后即可進(jìn)行樣品前處理。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 HPLC 條件 色譜柱為Waters XBridge C18柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm），等度洗脫，流動(dòng)相為甲醇?50 mmol/L 乙酸銨水溶液（1︰1），流速0.2 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μL。采用高效液相色譜儀檢測(cè)。

1.4.2 MS 條件 采用電噴霧離子化（electrospray ionization，ESI） 正離子模式和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）掃描方式，離子源溫度為700 ℃，離子噴霧電壓為5 000 V。在MRM模式下肌苷和內(nèi)標(biāo)物的定量離子對(duì)分別為m/z 269.1/137.1，m/z 230.2/112.2。去簇電壓為26 V，碰撞電壓為15 V。肌苷及拉米夫定結(jié)構(gòu)裂解形式見(jiàn)圖1。

圖1 肌苷及拉米夫定結(jié)構(gòu)裂解圖Fig 1 Chemical structures and fragmentations of inosine and lamivudine

1.5 溶液配制

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)血漿及質(zhì)控樣品的配制 取肌苷標(biāo)準(zhǔn)品適量，用流動(dòng)相溶液（甲醇︰50 mmol/L 乙酸銨水溶液=1︰1）溶解后得到肌苷儲(chǔ)備液。分別取適量?jī)?chǔ)備液，用空白血漿（室溫放置3 d）稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線所需濃度，其中肌苷的質(zhì)量濃度分別為28.5、57.0、114.0、228.0、456.0、

912.0 ng/mL。

1.5.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 取拉米夫定適量，用甲醇稀釋得到質(zhì)量濃度為1 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，備用。

1.5.3 血漿樣品的配制 全血取出后置于肝素化試管中，立即4 ℃冰浴，待樣品收集完畢后，1 123×g離心15 min，取 上 清 液250 μL，加 入 內(nèi) 標(biāo) 溶 液25 μL 及250 μL 的4.25%磷酸溶液，渦旋30 s，混勻后在HLB SPE 柱上樣。先后使用1 mL 水及1 mL 甲醇洗脫除雜，最后使用1 mL流動(dòng)相溶液收集，36 670×g 離心10 min，取上清液100 μL，按“1.4”項(xiàng)下條件檢測(cè)。

1.6 方法學(xué)驗(yàn)證

1.6.1 色譜柱及流動(dòng)相選擇 使用制備的質(zhì)控樣品，對(duì)檢測(cè)過(guò)程使用的色譜柱（Waters XBridge C18柱及Zorbax SB-C18柱）及流動(dòng)相（有機(jī)相：甲醇及乙腈。水相：10 mmol/L 及50 mmol/L 乙酸銨水溶液）進(jìn)行選擇，其他步驟按“1.4”項(xiàng)下條件進(jìn)行。根據(jù)肌苷及內(nèi)標(biāo)物的峰形、出峰時(shí)間以及信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)弱進(jìn)行選擇。

1.6.2 樣品前處理方法的選擇 血漿樣品的前處理過(guò)程中，分別用5 種SPE 小柱（Waters Oasis HLB、Oasis MCX、Oasis MAX、Oasis WCX、Oasis WAX）進(jìn)行考察與比較，其他步驟按“1.5.3”項(xiàng)下條件進(jìn)行樣品處理。根據(jù)肌苷的信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)弱進(jìn)行選擇。

1.6.3 專屬性考察 分別取6 名健康志愿者的空白血漿樣本，不加入內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)液及肌苷標(biāo)準(zhǔn)液。另取3份空白血漿樣本，分別僅加入內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)液、僅加入肌苷標(biāo)準(zhǔn)液和同時(shí)加入內(nèi)標(biāo)物及肌苷標(biāo)準(zhǔn)液，按照“1.5.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析。

1.6.4 血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限考察 取“1.5.1”項(xiàng)下肌苷標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按“1.5.3”項(xiàng)下方法處理，即得體內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。以肌苷與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值（x）對(duì)濃度（y）進(jìn)行線性回歸，加權(quán)最小二乘法作回歸運(yùn)算，得到回歸方程。

1.6.5 準(zhǔn)確度和精密度考察 按照“1.5.1”項(xiàng)下方法制備定量下限及低、中、高質(zhì)量濃度（28.5、57.0、228.0、912.0 ng/mL）的肌苷質(zhì)控樣品各6 份，再按“1.5.3”項(xiàng)下方法處理后，連續(xù)3 d 進(jìn)樣分析測(cè)定。根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各質(zhì)控樣品的實(shí)測(cè)濃度，考察本方法的準(zhǔn)確度以及日內(nèi)和日間精密度。

1.6.6 提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)考察 分別配制含肌苷的低、中、高質(zhì)量濃度（57.0、228.0、912.0 ng/mL）的質(zhì)控樣品，按“1.5.3”項(xiàng)下方法操作，每個(gè)濃度取6 份樣品進(jìn)樣分析；取人空白血漿按“1.5.3”項(xiàng)下方法操作后，取上清液分別加入適量的低、中、高質(zhì)量濃度的肌苷標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混合后離心，每個(gè)濃度平行測(cè)定6 個(gè)樣本；在250 μL 流動(dòng)相中分別加入25 μL 低、中、高濃度的肌苷質(zhì)控樣品，25 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，按照“1.5.3”項(xiàng)下方法處理，每個(gè)濃度取6 份樣品進(jìn)樣分析。肌苷或內(nèi)標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)=經(jīng)過(guò)前處理的空白基質(zhì)制備的樣本的峰面積/溶劑配制的樣本的峰面積×100%；肌苷或內(nèi)標(biāo)物的回收率=血清制備的樣本的峰面積/經(jīng)過(guò)前處理的空白基質(zhì)配制的樣本的峰面積×100%。

1.6.7 穩(wěn)定性考察 配制肌苷低、中、高3 個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，按“1.5.3”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣測(cè)定峰面積。分別考察樣品室溫放置4 h、反復(fù)凍融3 次、-70 ℃放置7 d 和處理后自動(dòng)進(jìn)樣器（4 ℃） 放置24 h 的穩(wěn)定性。

1.7 健康志愿者12 h血漿濃度測(cè)定

采用本方法測(cè)定2 例健康志愿者血漿中肌苷的濃度。分別于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3.5、4、5、6、8、10、12 h 抽取血漿，按“1.5.3”項(xiàng)下方法測(cè)定其中肌苷濃度。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

在進(jìn)行色譜柱及流動(dòng)相選擇過(guò)程中，確定使用Waters XBridge C18柱時(shí)，肌苷及內(nèi)標(biāo)物的峰形較好，出峰時(shí)間也較快。流動(dòng)相的組成對(duì)肌苷和內(nèi)標(biāo)物的電離程度有較大影響。有機(jī)相中，甲醇較乙腈可產(chǎn)生較高的信噪比且縮短了樣品的出峰時(shí)間；水相中，乙酸銨水溶液濃度為50 mmol/L 時(shí)相比濃度為10 mmol/L 時(shí)可產(chǎn)生更強(qiáng)的信號(hào)響應(yīng)。使用的SPE小柱以O(shè)asis HLB可獲得更高的回收率。

專屬性考察結(jié)果見(jiàn)圖2。6 名健康受試者的空白血漿樣本均無(wú)內(nèi)源性物質(zhì)干擾。在28.5～912.0 ng/mL 的范圍內(nèi)，肌苷的線性關(guān)系良好（R2＞0.999，表1）。肌苷在各濃度水平的日內(nèi)精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在3.1%～9.7%之間，日間精密度RSD在0.2%～7.0%之間，日內(nèi)和日間RSD 均小于10%；準(zhǔn)確度在96.9%～103.8%之間（表2）。準(zhǔn)確度和精密度符合生物樣品測(cè)定要求。提取回收率為98.9%～102.3%（表3）。在室溫放置4 h、反復(fù)凍融3 次、?70 ℃放置7 d 和處理后自動(dòng)進(jìn)樣器（4 ℃）放置24 h的情況下，肌苷的穩(wěn)定性變化率均小于15%（表4）。肌苷和內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間分別為2.5 min，分析運(yùn)行時(shí)間僅為4 min。

圖2 不同血漿樣品肌苷及拉米夫定MRM色譜圖Fig 2 Representative MRM chromatograms of inosine and lamivudine in different plasma samples

表1 線性關(guān)系與定量下限考察結(jié)果Tab 1 Results of linear relations and quantitative lower limits

表2 精密度和準(zhǔn)確度結(jié)果Tab 2 Results of precision and accuracy test

表3 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)Tab 3 Results of matrix effect and recovery test

表4 不同條件下穩(wěn)定性考察結(jié)果Tab 4 Results of stability test under different conditions

2.2 健康志愿者12 h血漿濃度測(cè)定

2 例健康志愿者血漿肌苷濃度的藥時(shí)曲線趨勢(shì)相似，均存在多個(gè)峰（圖3）。

圖3 2名健康志愿者的血漿中肌苷藥時(shí)曲線Fig 3 Observed concentration-time curves of inosine in plasma of two healthy volunteers

3 討論

目前，血漿樣品的前處理過(guò)程中較為常用的有蛋白沉淀法、液液萃取法和SPE 法。蛋白沉淀法和使用乙酸乙酯的液液萃取法均可導(dǎo)致肌苷的回收率和靈敏度處于較低的水平。而HPLC-MS/MS 法與SPE 法結(jié)合用于生物樣品的定量［19］在國(guó)外已被運(yùn)用。使用SPE 法，可以在滿足定量準(zhǔn)確度的同時(shí)，提高樣品的提取回收率。在分別考察了5 種SPE 小柱（Waters Oasis HLB、Oasis MCX、Oasis MAX、Oasis WCX、Oasis WAX） 后證實(shí)Waters Oasis HLB 小柱處理后的樣品，可獲得更好的回收率，并具有較低的基質(zhì)效應(yīng)。原因是Waters Oasis HLB小柱使用較平衡的親水和親脂性反相吸附劑，而肌苷作為一種親水親脂相對(duì)適中的化合物，可通過(guò)疏水作用與HLB 反相吸附劑相互作用，從而達(dá)到過(guò)濾和純化樣品的作用。

肌苷在血漿中不穩(wěn)定，為了確保樣品在處理及進(jìn)樣過(guò)程中的穩(wěn)定性，本方法將血漿樣品儲(chǔ)存在-70 ℃的超低溫冰箱中。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，血漿中的肌苷放置在室溫條件下，3 d 內(nèi)降解至初始濃度的3.5%，遠(yuǎn)低于定量下限（28.5 ng/mL），可視為已降解完全。故本方法所使用的空白血漿即使用此方法獲得。

由藥時(shí)曲線可推測(cè)，進(jìn)餐可能是影響人體血漿中肌苷濃度的重要因素之一。此外，肌苷的代謝途徑復(fù)雜多樣。作為人體嘌呤代謝的中間代謝產(chǎn)物，肌苷可由腺苷、次黃嘌呤核苷酸和次黃嘌呤產(chǎn)生，亦可以被代謝為次黃嘌呤以及次黃嘌呤核苷酸。由于代償性反應(yīng)，人體會(huì)進(jìn)行自我調(diào)節(jié)增加或減少包括肌苷在內(nèi)的內(nèi)源性物質(zhì)。其中，飲食、晝夜規(guī)律和生理周期會(huì)影響血漿中肌苷的濃度。而肌苷作為人體血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)，它的代償反應(yīng)機(jī)制至今仍尚未被發(fā)現(xiàn)。

本研究建立的測(cè)定人血漿中肌苷的SPE-HPLC-MS/MS 方法準(zhǔn)確、靈敏、簡(jiǎn)便。通過(guò)測(cè)定血漿中肌苷的濃度，可為臨床肌苷檢測(cè)提供有力依據(jù)，并且也可為后續(xù)的藥代動(dòng)力學(xué)研究提供支持。