吳任燕，郭曉琳，洪登禮，陳 磊

1.上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，細(xì)胞分化與凋亡教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200025；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院上海市免疫學(xué)研究所，上海200025

急性不明確譜系白血?。╝cute leukemia of ambiguous lineage，ALAL）是一種罕見(jiàn)的白血病類型，不能清楚地分為淋巴系和髓系，其發(fā)病率不到5%。根據(jù)2016 年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）分類標(biāo)準(zhǔn)［1］，ALAL 可分為多個(gè)亞型，包括急性未分化白血病（acute undifferentiated leukemia，AUL）、混合表型急性白血?。╩ixed phenotype acute leukemia，MPAL）等。盡管大多數(shù)白血病已經(jīng)得到了很好的研究和治療，但由于ALAL 的罕見(jiàn)性，目前普遍采用的是與急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）和急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）相同的治療手段，無(wú)法對(duì)ALAL 進(jìn)行針對(duì)性治療，使得ALAL 相 較 于AML/ALL 治 療 效 果 較 差［2-3］。因 此 探 究ALAL 發(fā)生和生存相關(guān)的基因和信號(hào)通路，有助于對(duì)ALAL發(fā)病機(jī)制的針對(duì)性研究，可為ALAL的臨床治療提供參考。

目前已有的研究主要針對(duì)ALAL的存活率、免疫分型以及相關(guān)microRNA 而開(kāi)展。白血病生存分析［4-5］顯示，大多數(shù)ALAL患者首選ALL的治療方案；免疫表型分析［6］顯示，早期T細(xì)胞前體淋巴細(xì)胞白血病和T/M-MPAL在免疫表型上相似，NOTCH1可作為T(mén) 細(xì)胞混合表型白血病的潛在治療靶點(diǎn)；通過(guò)高通量測(cè)序，ALAL可以根據(jù)具有譜系特性的microRNA 表達(dá)特性被歸類為AML 或ALL［7］。這些研究大多探討了ALAL與其他白血病的譜系關(guān)系，但有關(guān)ALAL獨(dú)特的基因表達(dá)譜、生存基因以及相關(guān)通路尚不清楚。高通量測(cè)序技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)，極大地推動(dòng)了對(duì)于疾病標(biāo)志物的研究進(jìn)展。通過(guò)對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析，我們可以對(duì)疾病的發(fā)病機(jī)制及治療靶標(biāo)進(jìn)行預(yù)測(cè)，為疾病的機(jī)制研究和藥物研發(fā)提供思路。

本研究利用小兒ALAL患者和健康對(duì)照組的表達(dá)譜數(shù)據(jù)（RNA-seq），對(duì)ALAL 中的差異表達(dá)基因（differential expressed genes，DEGs）進(jìn)行篩選，利用基因本體數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Ontology，GO） 和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，探討ALAL發(fā)病的生物學(xué)過(guò)程和相關(guān)信號(hào)通路；結(jié)合生存分析與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，我們發(fā)現(xiàn)了在ALAL中獨(dú)特的生存基因表達(dá)譜，鑒定了與ALAL生存相關(guān)的樞紐基因。本研究可為ALAL的臨床診斷和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 RNA-seq數(shù)據(jù)獲得

基因表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)自于兒童ALAL 患者和兒童健康對(duì)照者的血液或骨髓的RNA-seq 數(shù)據(jù)?；颊叩幕虮磉_(dá)數(shù)據(jù)是從UCSC xena 數(shù)據(jù)門(mén)戶GDC 下載TARGET-ALL-P3數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集由有效治療應(yīng)用研究（Therapeutically Applicable Research to Generate Effective Treatments，TARGET，https：//ocg.cancer.gov/programs/TARGET） 計(jì)劃生成。健康對(duì)照者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)（GSE111459）從基因表達(dá)匯編數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）下載。對(duì)異常樣本進(jìn)行過(guò)濾后，得到21 個(gè)健康兒童樣本和69 個(gè)初診兒童ALAL 樣本分別作為健康對(duì)照組和ALAL組。納入診斷樣本和復(fù)發(fā)樣本的數(shù)據(jù)用于不同類型白血病基因表達(dá)量比較，以TARGET-ALL-P2 的532 個(gè)ALL 樣本為ALL 組，以TARGET-AML 的187 個(gè)AML 樣本為AML 組，以TARGET-ALL-P3中的136個(gè)ALAL 患者樣本為ALAL 完全組。所有患者的數(shù)據(jù)均可從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）獲得。

1.2 前期處理及DEGs篩選

所有樣本的表達(dá)量數(shù)據(jù)均被標(biāo)準(zhǔn)化為每百萬(wàn)片段計(jì)數(shù)（count per million，CPM）值以進(jìn)行相關(guān)性分析和去除低測(cè)序質(zhì)量樣本。低表達(dá)基因（在所有樣本中均CPM＜1.5）和離群基因（＜Q1-1.5×IQR或＞Q3+1.5×IQR）被移除。利用Pearson相關(guān)分析方法對(duì)樣本表達(dá)譜相關(guān)性進(jìn)行分析。R語(yǔ)言limma軟件包［8］用于鑒別ALAL標(biāo)本與健康對(duì)照組之間的差異表達(dá)基因。采用Benjamini和Hochberg 修正法對(duì)多次試驗(yàn)進(jìn)行修正，得到修正后的P 值（adjusted Pvalue）。為消除假陽(yáng)性結(jié)果，DEGs的篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2Fold Change|（|log2FC|）＞2且修正后的P＜0.001。

1.3 DEGs的功能分析

為驗(yàn)證數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性，利用R 語(yǔ)言DOSE 軟件包［9］進(jìn) 行DEGs 的 疾 病 本 體 論（Disease Ontology，DO）［10］分 析。為 研 究ALAL 中 的 相 關(guān) 通 路，使 用clusterProfiler［11］的默認(rèn)參數(shù)對(duì)上調(diào)和下調(diào)的DEGs 分別進(jìn)行GO和KEGG富集分析。顯著性篩選標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。

1.4 生存相關(guān)基因鑒定及其與AML/ALL的表達(dá)比較

69 例ALAL 患者中有48 個(gè)病例有總生存時(shí)間記錄，并選擇用于生存相關(guān)基因的鑒定。根據(jù)每個(gè)基因在所有樣本中的平均表達(dá)量，48個(gè)樣本被分為基因的高表達(dá)組和低表達(dá)組。生存分析采用R 語(yǔ)言的survival和survminer軟件包進(jìn)行，Cox 回歸模型用于鑒定生存相關(guān)基因；以P＜0.05，在表達(dá)下調(diào)的基因中相關(guān)系數(shù)＞0或在表達(dá)上調(diào)的差異基因中相關(guān)系數(shù)＜0，被認(rèn)為是合理的ALAL生存相關(guān)基因。生存分析是針對(duì)與正常樣本的差異基因進(jìn)行，所得到的生存相關(guān)基因可能與小兒ALAL的致病相關(guān)，但這些生存相關(guān)基因的具體作用仍有待進(jìn)一步的機(jī)制研究。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及樞紐基因篩選

將生存相關(guān)基因?qū)隚eneMANIA［12］構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network，PPI），該網(wǎng)絡(luò)中總共包含22 個(gè)ALAL 生存相關(guān)基因以及100 個(gè)與這些基因具有功能或表達(dá)相關(guān)性的間接相關(guān)基因。利 用Cytoscape［13］繪 制PPI 網(wǎng) 絡(luò) 圖 譜，并 利 用Cytohubba［14］計(jì)算網(wǎng)絡(luò)圖中每一個(gè)基因的最大群體中心度（maximal clique centrality，MCC），得分值最高的前10個(gè)基因，被認(rèn)為是PPI網(wǎng)絡(luò)中的樞紐基因。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控

由于測(cè)序技術(shù)的特性，我們需要對(duì)不同來(lái)源的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，以提高最后分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。在去除低質(zhì)量樣本和離群基因后，在原始數(shù)據(jù)中篩選出總共90個(gè)樣本的19 213 個(gè)基因的表達(dá)值進(jìn)行后續(xù)分析，其中包括21 個(gè)健康對(duì)照組和69 個(gè)兒童ALAL 組的樣本。標(biāo)準(zhǔn)化前后的表達(dá)值如圖1A 所示。在ALAL 組和對(duì)照組中的基因表達(dá)量顯示出較高的內(nèi)部樣本相關(guān)性（圖1B），證明篩選得到的數(shù)據(jù)內(nèi)部表達(dá)譜具有均質(zhì)性，可以用于后續(xù)分析。樣本編號(hào)與原始數(shù)據(jù)編號(hào)的對(duì)應(yīng)關(guān)系見(jiàn)附表1。

圖1 樣本數(shù)據(jù)質(zhì)控Fig 1 Quality control of sample data

表1 生存相關(guān)基因在不同類白血病患者及健康對(duì)照者中的表達(dá)值（log2CPM）Tab 1 The log2CPM value of survival-related genes in the control and different leukemia types

2.2 DEGs篩選與功能分析

為進(jìn)一步探究?jī)和疉LAL 的異?；虮磉_(dá)譜，利用limma 軟件包對(duì)ALAL 組和健康對(duì)照組的基因表達(dá)譜進(jìn)行差異分析；選擇|log2FC|＞2、校正后的P＜0.001 為條件進(jìn)行基因篩選，去除假陽(yáng)性基因，共鑒定得到4 053 個(gè)基因，其中上調(diào)基因1 844 個(gè)，下調(diào)基因2 209 個(gè)?；谒蠨EGs 的DO 分析表明造血系統(tǒng)疾病是最顯著富集的疾?。▓D2A），與我們的數(shù)據(jù)特征相符，進(jìn)一步證明我們篩選使用的樣本數(shù)據(jù)和差異分析的合理性。對(duì)上調(diào)和下調(diào)的差異基因分別進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，找尋與ALAL 發(fā)病相關(guān)的信號(hào)通路，各組顯著富集的前10 個(gè)生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路如圖2B 及圖2C 所示。ALAL 組中與免疫相關(guān)的生物學(xué)進(jìn)程、造血細(xì)胞譜系和細(xì)胞黏附分子相關(guān)的信號(hào)通路明顯下調(diào)，而細(xì)胞周期、有絲分裂以及剪接相關(guān)的生物學(xué)進(jìn)程在ALAL 組中明顯富集。

圖2 差異基因的功能分析Fig 2 Functional analysis of DEGs

2.3 生存相關(guān)基因篩選及表達(dá)譜的比較

利用ALAL 患者的總體生存期資料，我們從4 053 個(gè)差異表達(dá)基因中鑒定出31 個(gè)ALAL 生存相關(guān)基因。其中13 個(gè)基因在ALAL 組中表達(dá)量增加，與生存呈負(fù)相關(guān)，被認(rèn)為是負(fù)生存相關(guān)基因；18 個(gè)基因在ALAL 組中表達(dá)降低，與生存呈正相關(guān)，被認(rèn)為是正生存相關(guān)基因。

此外，為了研究這些基因是特異在ALAL 中表達(dá)變化還是白血病的普遍差異基因，我們?cè)贏LL 組以及AML組的表達(dá)譜中對(duì)這些基因進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明，與ALAL 生存相關(guān)的基因，在ALL 組以及AML 組中呈現(xiàn)出同樣的差異表達(dá)趨勢(shì)，相對(duì)于健康組，在ALAL 完全組中表達(dá)上調(diào)的基因同樣在ALL 組和AML 組中表達(dá)上調(diào)，但這些基因的表達(dá)量在各類型白血病之間仍然存在顯著差異（表1）。這些基因中也有一些“偏向性”表達(dá)特例，SMARCA5-AS1 在AML 組中的表達(dá)與對(duì)照組相比差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.151），但在ALAL完全組和ALL 組中表達(dá)較對(duì)照組有明顯增加（均P=0.000）。ZNF135在ALAL完全組和AML組中的表達(dá)值均低于對(duì)照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.000），但在ALL 患者中表達(dá)量無(wú)明顯變化（P=0.073）。這些數(shù)據(jù)為研究ALAL的獨(dú)特生存特征及治療方案的選擇提供了線索。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建以及樞紐基因識(shí)別

樞紐基因是在PPI網(wǎng)絡(luò)中具有緊密的相互聯(lián)系，發(fā)揮核心作用的一群基因。為了進(jìn)一步篩選出在ALAL 患者生存中發(fā)揮關(guān)鍵作用的樞紐基因，我們將所有生存相關(guān)基因?qū)氲紾eneMANIA 中，構(gòu)建了PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖3A）。GeneMANIA 中的GO 富集分析顯示細(xì)胞趨化性和白細(xì)胞遷移相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程在這個(gè)相互作用網(wǎng)絡(luò)中顯著富集，提示ALAL 患者的生存與細(xì)胞趨化性及白細(xì)胞遷移相關(guān)。在這個(gè)PPI 網(wǎng)絡(luò)中MCC 得分最高的前10 個(gè)基因被認(rèn)為是這個(gè)PPI 網(wǎng)絡(luò)中的樞紐基因（圖3B）。在這10 個(gè)基因中，只有CXCL8 和LMNA 與ALAL 的生存相關(guān)且在ALAL 組中表達(dá)量發(fā)生變化，被鑒定為ALAL 的生存相關(guān)樞紐基因。在ALAL 組和健康對(duì)照組中CXCL8 和LMNA 的生存曲線和表達(dá)譜如圖3C 和圖3D 所示，CXCL8 和LMNA 均為負(fù)生存相關(guān)基因，在ALAL組中表達(dá)上調(diào)，伴隨ALAL患者總生存期下降。

圖3 ALAL生存相關(guān)樞紐基因鑒定Fig 3 Survival-related hub genes identification and its character.

3 討論

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析的方法，將基因表達(dá)數(shù)據(jù)與臨床生存數(shù)據(jù)結(jié)合，對(duì)ALAL 的生存相關(guān)樞紐基因進(jìn)行篩選。為使得研究結(jié)果更加準(zhǔn)確，我們首先對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)進(jìn)行了篩選，得到21 個(gè)健康樣本（GSE111459） 和69 個(gè)ALAL 樣 本（TARGET-ALL-P3）的共19 213 個(gè)基因表達(dá)數(shù)據(jù)?；虮磉_(dá)譜的差異分析顯示在ALAL組中有1 844個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，2 209個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，揭示了ALAL 的異?；虮磉_(dá)譜。疾病本體分析的結(jié)果顯示造血系統(tǒng)疾病在差異基因中高度富集，進(jìn)一步驗(yàn)證了我們的數(shù)據(jù)以及差異分析的可靠性。GO 以及KEGG富集分析表明在ALAL組中上調(diào)表達(dá)的基因主要富集細(xì)胞周期以及有絲分裂的相關(guān)進(jìn)程，而下調(diào)的差異基因在造血細(xì)胞譜系相關(guān)通路和免疫相關(guān)進(jìn)程中富集。白血病的主要特征為造血干細(xì)胞的惡性增殖和分化障礙，因此細(xì)胞周期及有絲分裂進(jìn)程的上調(diào)，造血細(xì)胞譜系相關(guān)進(jìn)程的下調(diào)，符合白血病的基本特性。但目前尚未有研究指出ALAL 中免疫相關(guān)進(jìn)程的下調(diào)，因此本研究中找到的通路可能為ALAL的免疫學(xué)治療提供理論依據(jù)。

結(jié)合臨床生存記錄，我們從ALAL 的差異基因中篩選出了31 個(gè)與生存相關(guān)的基因。由于目前ALAL 缺乏明確的靶向治療方案，ALAL 的治療普遍是采用ALL 或者AML 的治療方案進(jìn)行，但這些治療往往帶來(lái)較差的預(yù)后效果［2-3］，因此我們將ALAL 的生存相關(guān)基因表達(dá)譜與ALL/AML 進(jìn)行比較，探究特異在ALAL 中異常表達(dá)的生存基因。結(jié)果顯示大多數(shù)基因在ALAL、AML 和ALL 中具有共同的上下調(diào)趨勢(shì)，這些ALAL 的生存相關(guān)基因，在AML/ALL 中同樣差異表達(dá)，具有白血病致病的普遍性。但這些基因在各個(gè)白血病類型之間的表達(dá)譜存在明顯差異，ALAL 的生存相關(guān)基因表達(dá)量大多數(shù)介于ALL和AML 之間，表現(xiàn)出與ALAL 生存相關(guān)的特殊基因表達(dá)譜。此外我們發(fā)現(xiàn)，在這些基因中存在一些明顯的“偏向”調(diào)節(jié)的情況，如SMARCA5-AS1 在ALAL 和ALL 中表達(dá)增加，但在AML 中沒(méi)有改變；ZNF135 在ALAL 和AML 中表達(dá)下調(diào)，但在ALL 中沒(méi)有改變。這些數(shù)據(jù)可能為ALAL治療方案的選擇提供借鑒作用。

此外，通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)圖譜的構(gòu)建，我們進(jìn)一步篩選出CXCL8 和LMNA 作為ALAL 生存相關(guān)的樞紐基因。CXCL8 又稱IL-8，是CXC 趨化因子家族的成員。CXCL8可從白細(xì)胞和非白細(xì)胞的體細(xì)胞中釋放，在炎癥中經(jīng)常上調(diào)表達(dá)，并在白細(xì)胞誘導(dǎo)遷移和釋放反應(yīng)中發(fā)揮作用［15］。近期的研究表明，白血病細(xì)胞廣泛釋放CXCL 和CCL 趨化因子，尤其是高水平地釋放CXCL8［16］；CXCL8與AML 的復(fù)發(fā)有關(guān)，CXCL8 的敲除導(dǎo)致G0/G1 細(xì)胞周期阻滯、凋亡和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2 信號(hào)通路失活［17］；CXCL8 可與CXCR1/2 相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化，介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［18-19］。然而，CXCL8 在ALAL 中是否發(fā)揮作用尚不清楚。在本研究中，CXCL8 在ALAL中表達(dá)上調(diào)；并在ALAL 患者的生存中充當(dāng)樞紐基因，ALAL 患者中富集與細(xì)胞周期相關(guān)的信號(hào)通路，CXCR1/2在ALAL 中表達(dá)下調(diào)，結(jié)合已有報(bào)道，我們推測(cè)CXCL8可能通過(guò)參與細(xì)胞周期的進(jìn)程介導(dǎo)了ALAL 的發(fā)生和發(fā)展，而并非通過(guò)與CXCR1/2 相互作用參與ALAL 的發(fā)生。LMNA 編碼核包膜蛋白lamin A 和lamin C，主要參與染色質(zhì)組織、核組裝和端粒動(dòng)力學(xué)，與涉及凋亡和存活的Caspase 級(jí)聯(lián)途徑有關(guān)。LMNA 突變引起多種疾病［20-21］，但在白血病中對(duì)LMNA 的研究非常少。此前，有報(bào)道稱LMNA 在活性T 細(xì)胞中被誘導(dǎo)表達(dá)［22］，但LMNA 在造血細(xì)胞中的表達(dá)情況尚不明確。通過(guò)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，我們?cè)趯?duì)照組和ALAL 組中均檢測(cè)到LMNA，并且LMNA 在ALAL患者中的表達(dá)明顯高于對(duì)照組。我們的結(jié)果首次提出LMNA在ALAL的發(fā)生和生存中發(fā)揮作用。

綜上所述，我們對(duì)兒童ALAL 病例的獨(dú)特基因表達(dá)譜進(jìn)行了研究，確定了參與ALAL 發(fā)生的信號(hào)通路及生物學(xué)進(jìn)程，并將ALAL 生存相關(guān)基因的表達(dá)譜與ALL 和AML 的表達(dá)譜進(jìn)行了比較，為研究ALAL 的獨(dú)特生存特征和現(xiàn)有治療方案的選擇提供了線索。基于生存期分析找到了ALAL生存相關(guān)樞紐基因，可能作為潛在的ALAL治療靶點(diǎn)，但這些樞紐基因的功能仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。