王平，孟立平，劉龍斌，郭航遠，3，4

1.紹興市人民醫(yī)院 浙江大學紹興醫(yī)院 心內(nèi)科，浙江 紹興 312000；2.紹興文理學院附屬醫(yī)院 紹興市立醫(yī)院 心內(nèi)科，浙江 紹興 312000；3.溫州醫(yī)科大學 研究生院，浙江 溫州 325035；4.紹興文理學院醫(yī)學院，浙江 紹興 312000

糖尿病性心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是發(fā)生在糖尿病患者身上的一種獨立于冠心病、心臟瓣膜病等心血管疾病的影響心臟結(jié)構(gòu)和功能的病變[1]。糖代謝異常及微血管病變所引起的心肌細胞凋亡和心臟纖維化是DCM的主要病理特征，導致患者心功能損害，并最終進展為心力衰竭、心律失常及心源性休克。隨著糖尿病的發(fā)病率在全球逐年增加，DCM的發(fā)病率也隨之升高，已成為影響糖尿病患者生活質(zhì)量以及預后的重要因素[2]。

心臟成纖維細胞的激活和心肌細胞的變性是心臟重構(gòu)的細胞生物學基礎(chǔ)，也是DCM形成的病理生理基礎(chǔ)[2]。心臟成纖維細胞由靜止型活化為激活型，增殖和遷移能力增加，并開始大量分泌細胞外基質(zhì)，分泌MMP-2和TIMP-1等影響細胞外基質(zhì)動態(tài)平衡的蛋白酶，造成心臟間質(zhì)的纖維化，最終導致心肌重構(gòu)[3-4]。

鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白（sodiumglucose cotransporter，SGLT）屬于溶質(zhì)載體5基因家族，以消耗能量的方式逆濃度梯度轉(zhuǎn)運葡萄糖，在葡萄糖的主動轉(zhuǎn)運過程中起著重要的作用[5]。我們過去的研究發(fā)現(xiàn)高糖可以促進心臟成纖維細胞中SGLT1和MMP-2的表達[6]，但是高糖是否是通過誘導心臟成纖維細胞激活從而促進心臟的纖維化，SGLT1是否參與高糖誘導的心臟成纖維細胞激活尚未見研究報道。本研究擬通過細胞實驗探索高糖是否能促進心臟成纖維細胞的激活以及SGLT1在其中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 葡萄糖購自美國Sigma公司；胎牛血清、胰酶以及青霉素和鏈霉素購自美國Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基（用于后續(xù)實驗）、DMEM高糖培養(yǎng)基（用于原代細胞培養(yǎng)）、PBS購自杭州吉諾公司；MTT、EdU購自美國Emresco公司；Transwell小室購自美國康寧公司；DAPI購自美國Rcohe公司；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑和TRIzol RNA試劑盒購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京Promega公司；si-SGLT1購自上海吉凱生物公司；SGLT1抗體購自美國Abcom公司；辣根過氧化酶及FITC標記的二抗購自美國Jackson公司；蛋白免疫印跡相關(guān)試劑購自蘇州碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 分組及干預：為了探索高糖對心臟成纖維細胞激活的影響，用不同濃度的葡萄糖干預心臟成纖維細胞，將細胞分為4組，對照組（不加任何干預因素），5.5 mmol/L葡萄糖組，30 mmol/L葡萄糖組，100 mmol/L葡萄糖組。為了進一步探索SGLT1在高糖誘導的心臟成纖維細胞激活中的作用，將帶有si-SGLT RNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進心臟成纖維細胞中抑制細胞中SGLT1的表達，將細胞分為3組，對照組（不加任何干預因素），高糖組（加濃度為30 mmol/L的葡萄糖），si-SGLT1組（在轉(zhuǎn)染si-SGLT質(zhì)粒之后，再加入30 mmol/L的葡萄糖）。

1.2.2 光鏡下觀察細胞形態(tài)：取4～7代培養(yǎng)細胞，0.25%胰蛋白酶消化單層心臟成纖維細胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配成細胞懸液并計數(shù)，以每孔1×106個細胞接種于6孔培養(yǎng)板中。待細胞貼壁后，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使細胞同步化。各組細胞按上述分組分別干預，細胞于37 ℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)24 h后，光鏡記錄各組細胞形態(tài)。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖：每孔6×103個心臟成纖維細胞接種于96 孔板中。各組細胞按上述分組加入對應濃度的干預因子，每組設(shè)4個復孔，2個不加細胞的空白對照孔。細胞于37 ℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)24、48、72 h。培養(yǎng)結(jié)束，每孔加入MTT液20 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4～6 h，終止培養(yǎng)，小心棄去培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min，選擇490 nm波長于酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光值并記錄。以時間為橫軸，吸光值為縱軸繪制心臟成纖維細胞生長曲線。

1.2.4 EdU法測細胞增殖能力：將按上述分組要求處理的細胞調(diào)整濃度為1×104/mL，取100 μL接種于96孔板，用EdU孵育2 h后用多聚甲醛固定，流水沖洗后，用2 μg/mL的DAPI染核，PBS沖洗后，熒光顯微鏡下隨機取5個視野計數(shù)穿膜細胞數(shù)和EdU染色陽性細胞數(shù)并記錄。

1.2.5 細胞劃痕實驗測細胞遷移能力：細胞鋪滿板底后，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使細胞同步化，加入1.8 mmol/L羥基脲作用12 h抑制細胞增殖。用100 μL黃色槍頭垂直于孔板制造細胞劃痕，吸去細胞培養(yǎng)液，用PBS沖洗孔板3次，洗去劃痕產(chǎn)生的細胞碎片。加入各組相應的干預因子，拍照記錄0、12、24、48、72、96 h圖片，用Image Pro Plus 6.0分析計算出細胞遷移的面積，細胞遷移的面積與最開始的劃痕面積的比值表示遷移的多少。

1.2.6 Transwell法測細胞遷移能力：取4～7 代心臟成纖維細胞，血清饑餓使細胞同步化，加入1.8 mmol/L羥基脲作用12 h抑制細胞增殖，0.25%胰蛋白酶消化單層心臟成纖維細胞，用含有各組干預因子的DMEM培養(yǎng)基（無血清）配成細胞懸液并計數(shù)（3×104/mL）。各組24孔板配套的Transwell小室（0.8 μm）上室加入200 μL細胞懸液，下室加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基500 μL，分別培養(yǎng)4、8、12、24、48 h。干預結(jié)束后以棉簽輕輕擦去上層未穿透膜的細胞，取下Transwell半透膜，TBS洗滌3次，3.7%多聚甲醛室溫固定5 min，流水沖洗后，用2 μg/mL的DAPI染核，PBS沖洗后，熒光顯微鏡下隨機取5個視野計數(shù)穿膜細胞數(shù)并記錄。

1.2.7 轉(zhuǎn)染細胞株：si-SGLT1 質(zhì)粒的構(gòu)建：si-SGLT1質(zhì)粒由上海吉凱公司設(shè)計合成，通過PubMed查找SGLT1基因的序列，引物根據(jù)GeneBank中SGLT1 mRNA序列設(shè)計引物。si-SGLT1基因和質(zhì)粒DNA連接后，篩選重組質(zhì)粒，測序驗證。轉(zhuǎn)染：將心臟成纖維細胞系接種至6孔板，生長至50%～70%密度時，以脂質(zhì)體3000分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)?；騭i-SGLT1質(zhì)粒各100 pmol 24 h后，提取總RNA/蛋白后，PCR/Western blot鑒定轉(zhuǎn)染效率。

1.2.8 熒光定量RT-PCR檢測基因表達：提取細胞中總RNA，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應體系為20 μL，反應條件為：16 ℃（30 min），45 ℃（30 min），85 ℃（5 min）。運用SYBR Green法檢測SGLT1、SMα、Tcf21的表達情況，反應條件為：94 ℃（15 min），94 ℃（30 s），60 ℃（30 s），72 ℃（30 s），共循環(huán)40次；最后72 ℃延伸8 min。每次擴增設(shè)置無模板cDNA的陰性對照，內(nèi)參基因GAPDH為陽性對照。每組樣品重復3 次，試驗重復3 次，使用2-△△Ct法計算各標本中mRNA的表達。

圖1 高糖誘導的活化成纖維細胞的形態(tài)

圖2 高糖促進細胞遷移

1.2.9 Western blot測定心臟成纖維細胞中SGLT1的表達：各個干預因子干預48 h之后，裂解細胞提取蛋白，BCA法蛋白定量，SDS-PAGE膠每孔加入20 μL樣品，80 V 30 min進行蛋白濃聚，120 V 2 h進行凝膠電泳，并用孔徑0.45 μm硝酸纖維素膜250 mA 90 min進行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完畢經(jīng)常溫下TBST洗膜3次、脫脂奶粉封閉2 h后加入SGLT1一抗（1:1 000），4 ℃孵育過夜，常溫下TBST洗膜3次，辣根過氧化物酶標記的二抗孵育后ECL化學發(fā)光法檢測目標蛋白。暗室柯達膠片顯影，Quantity One軟件定量分析。

圖3 高糖促進細胞增殖

圖4 高糖增加激活型成纖維細胞標志物的表達

1.2.10 免疫熒光法檢測各組中SGLT1在細胞中的分布及表達：將細胞接種于96孔板，每孔3 000～5 000個細胞，待細胞貼壁后加入各組干預因子，在細胞融合之前進行檢測。先PBS洗3遍，用4%多聚甲醛固定，0.25% Triton×100穿破細胞膜，山羊血清室溫封閉1 h，加入稀釋了250倍的anti-SGLT1抗體，4 ℃過夜，PBST清洗3遍之后加入結(jié)合有FICT或者FRICT的二抗，室溫孵育1 h后PBST清洗3遍，熒光顯微鏡拍照后Iamge Pro Plus 6.0分析。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 實驗數(shù)據(jù)分析采用SPSS20.0軟件分析。計量資料以±s 表示，每組實驗重復3次，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖5 高糖促進成纖維細胞中SGLT1的表達（免疫熒光，×100）

圖6 si-SGLT1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細胞的轉(zhuǎn)染效率（×20）

2 結(jié)果

2.1 高糖對心臟成纖維細胞形態(tài)的影響 光鏡下各組細胞的形態(tài)不同，對照組中的心臟成纖維細胞細長，呈典型的梭形，用不同濃度的高糖干預后，細胞失去細長的形態(tài)，逐漸變短，變圓，見圖1。

2.2 高糖促進心臟成纖維細胞的遷移能力 劃痕和Transwell實驗結(jié)果顯示在加入各組干預因素后，相比于對照組，30、100 mmol/L葡萄糖組細胞遷移能力增加（P＜0.05），且隨葡萄糖的濃度增加而增加，見圖2。

2.3 高糖促進心臟成纖維細胞的增殖能力 EdU實驗和MTT檢測結(jié)果顯示，30、100 mmol/L葡萄糖促進心臟成纖維細胞增殖（P＜0.05），且隨葡萄糖濃度增加而增強，見圖3。

2.4 高糖促進心臟成纖維細胞中SMα、Tcf21 的表達 RT-qPCR結(jié)果顯示，相比于對照組，30、100 mmol/L葡萄糖組細胞中SMα和Tcf21的表達增加（P＜0.05），并與葡萄糖的濃度呈正相關(guān)，見圖4。

2.5 高糖促進心臟成纖維細胞中SGLT1 的表達RT-qPCR和Western blot實驗結(jié)果顯示，相比于對照組，30、100 mmol/L葡萄糖組細胞中SGLT1在mRNA和蛋白水平的表達都增加（P＜0.05）；免疫熒光染色結(jié)果顯示心臟成纖維細胞中有SGLT1的表達，SGLT1主要表達于細胞內(nèi)而非細胞膜上，并且高糖可以增加細胞中SGLT1的表達。見圖5。

2.6 熒光顯微鏡及PCR觀察轉(zhuǎn)染效率 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染6 h后，于熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)帶有熒光的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞內(nèi)，RT-qPCR進一步驗證結(jié)果顯示，si-SGLT1組細胞中SGLT1 mRNA表達降低（P＜0.05），見圖6。

2.7 高糖通過上調(diào)SGLT1促進心臟成纖維細胞激活相較于30 mmol/L葡萄糖組，si-SGLT1組細胞形態(tài)細長，細胞遷移能力和增殖能力減弱，細胞中SMα、Tcf21和SGLT1的表達降低（P＜0.05），提示敲除SGLT1可以抑制高糖誘導的心臟成纖維細胞激活，見圖7。

3 討論

在正常心臟組織中，心臟成纖維細胞處于靜息狀態(tài)，主要起構(gòu)成心臟網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)的作用。靜止型心臟成纖維細胞外觀呈梭形，增殖和遷移能力弱[7]。當受到各種炎癥介質(zhì)、細胞因子、物理張力等病理刺激的作用下，靜止型的心臟成纖維細胞被激活，轉(zhuǎn)化成激活型的成纖維細胞。激活型的細胞具有以下特點：①各種促炎和促纖維化因子表達水平升高，直接促成炎癥細胞浸潤和成纖維細胞增殖；②分泌高水平的MMP以促進成纖維細胞遷移；③促進膠原蛋白和其他細胞外基質(zhì)蛋白的沉積，導致瘢痕形成；④表達SMα、Tcf21等特異性的標志蛋白[3，8-10]。在各種病理因子的刺激下，被激活的心臟成纖維細胞大量增殖遷移并分泌MMP-2等促進心臟重構(gòu)的蛋白酶，最終導致心臟纖維化瘢痕組織的形成和心臟的重構(gòu)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)高糖可以改變心臟成纖維細胞形態(tài)，促進細胞的增殖和遷移，并且增加細胞中SMα和Tcf21的表達，上述結(jié)果表明高糖可以促經(jīng)心臟成纖維細胞的激活。這可能是高糖引起心臟纖維化和心臟重構(gòu)，最終導致DCM形成的病理機制。

SGLT1以消耗能量的方式逆濃度梯度將葡萄糖轉(zhuǎn)運入細胞內(nèi)，在機體的糖代謝中具有重要的作用。過去認為SGLT1只表達于小腸刷狀緣和腎近曲小管，在人體其他器官沒有表達，ZHOU等[11]的研究結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)心肌細胞中也有SGLT1的表達，并且陸續(xù)有研究報道心臟中SGLT1的表達與一些心臟疾病密切相關(guān)。BANERJEE等[12]通過檢測死亡患者的心臟標本，發(fā)現(xiàn)SGLT1在缺血性心肌病和擴張性心肌病患者心臟中表達增加。同樣的，DI FRANCO等[13]通過檢測9例缺血性心肌病和5例肥厚性心肌病患者的心臟組織，發(fā)現(xiàn)SGLT1的表達增加。我們過去的研究發(fā)現(xiàn)除心肌細胞之外，心臟成纖維細胞中也有SGLT1的表達[6]。但是，心臟成纖維細胞中的SGLT1是否參與DCM的進程，SGLT1在DCM的發(fā)生發(fā)展中起到了怎樣的作用，目前尚未見有研究報道。

MARGOLSKEE等[14]發(fā)現(xiàn)高糖可以促進SGLT1在小腸上皮細胞中的表達，LEE等[15]發(fā)現(xiàn)葡萄糖還可以促進腎小管上皮細胞中SGLT1的表達。與上述研究結(jié)果相似，本研究用不同濃度的葡萄糖干預心臟成纖維細胞，發(fā)現(xiàn)高糖可以促進心臟成纖維細胞的激活的同時，也可以促進心臟成纖維細胞中SGLT1的表達。為了進一步驗證SGLT1在高糖誘導的心臟成纖維細胞激活中的作用，我們使用si-SGLT1預先敲除細胞中SGLT1的表達，發(fā)現(xiàn)si-SGLT1可以抑制高糖誘導的心臟成纖維細胞激活，上述結(jié)果表明高糖通過上調(diào)SGLT1促進心臟成纖維細胞激活。

SGLT1是葡萄糖轉(zhuǎn)運載體，在DCM的發(fā)展過程中，心臟一直處于高糖負荷狀態(tài)，高糖上調(diào)的SGLT1可以將更多的葡萄糖轉(zhuǎn)運入心臟成纖維細胞，增加細胞內(nèi)葡萄糖和能量負荷，進一步引起細胞內(nèi)的代謝紊亂，最終導致心臟成纖維細胞的激活[12，16-17]?；谝陨戏治?，結(jié)合我們過去發(fā)現(xiàn)的SGLT1抑制劑可以降低高糖誘導的MMP-2的表達，恢復細胞外基質(zhì)的動態(tài)平衡這一結(jié)果[6]，推測抑制SGLT1可以減少高糖誘導的心臟成纖維細胞激活，對糖尿病患者來講，SGLT1抑制劑具有心臟保護作用。