龔成燕，李連峰，陳杰，胡博，趙建軍

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130112；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 楊凌 712100；4.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江 大慶 163319）

犬瘟熱（Canine distemper, CD）是由犬瘟熱病毒（Canine distemper virus, CDV）感染引起的一種熱性、高度接觸性傳染病[1]。CDV 宿主范圍廣泛，可感染食肉目多個(gè)物種，包括犬科、貓科、鼬科、鬣狗科和熊科等，引起肉食動(dòng)物多系統(tǒng)疾病，并伴有嚴(yán)重的免疫抑制[4]，甚至對(duì)非人靈長類具有感染致死的能力[2,3]。CDV 屬于副粘病毒科麻疹病毒屬成員，該屬成員還包括麻疹病毒（measles virus,MV）、小反芻獸疫病毒（peste despetits ruminants virus,PPRV）和被根除的牛瘟病毒（rinderpest virus, RPV）[5]。病毒基因組為單鏈負(fù)股RNA，長度為15 690 nt，共編碼8 個(gè)蛋白。包括核衣殼蛋白（N）、血凝素（H）、基質(zhì)膜蛋白（M）、磷蛋白（P）、病毒聚合酶（L）、融合蛋白（F）以及兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白C 和V[6]。盡管CDV 疫苗接種極大地限制了CDV的傳播，但仍有免疫動(dòng)物發(fā)生CDV 感染的情況[7]。因此，深入了解CDV 逃逸宿主的分子機(jī)制，將有助于通過識(shí)別藥理抑制靶點(diǎn)來設(shè)計(jì)新的治療策略，從而在某些情況下增強(qiáng)或取代疫苗。

麻疹病毒屬成員具備多種策略來逃避宿主先天免疫系統(tǒng)。MV、PPRV、RPV 和CDVV 蛋白均可干擾酪氨酸激酶2（Tyrosine kinase 2,Tyk2）的磷酸化，并阻止信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducers and activators of transcription,STAT）STAT 1 和STAT 2 激活，最終導(dǎo)致對(duì)I型干擾素（interferon,IFN）信號(hào)通路的阻斷[8]；Fontana 等[9]通過研究MV 弱毒疫苗株和野生毒株C、V 蛋白對(duì)干擾素信號(hào)的調(diào)控，發(fā)現(xiàn)V 蛋白比C 蛋白對(duì)IFN 的表達(dá)具有更強(qiáng)的抑制作用；通過研究PPRV野毒株和疫苗株對(duì)IFN- 的表達(dá)的影響，證實(shí)PPRV V蛋白分別通過與黑色素瘤分化相關(guān)抗原5（melanoma differentiation-associated gene-5, MDA5）和維甲酸誘導(dǎo)基因（Retinoic acid-inducible gene I,RIG-I）相互作用抑制IFN 通路[10]。

N 蛋白在CDV 蛋白中的含量最高，同時(shí)也是核蛋白核心的主要組成元素，具有很高的保守性，在病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中起主要作用，與CDV毒力密切相關(guān)[11-14]。H 蛋白是構(gòu)成CDV 粒子囊膜表面的纖突，具有血凝素功能，與細(xì)胞受體結(jié)合，是病毒入侵宿主的重要調(diào)節(jié)蛋白[13,15]。H 蛋白易變異，從而引起CDV 毒力的變異[16]。表達(dá)MV Edmonston 疫苗株H 蛋白的重組MV 野毒株感染獼猴后，病毒在體內(nèi)的復(fù)制水平減弱[17]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在感染表達(dá)疫苗株H 蛋白重組MV 的獼猴體內(nèi)，IFN-被誘導(dǎo)表達(dá)，而在感染MV 野毒株的獼猴中，IFN-表達(dá)受到抑制[18]。干擾素調(diào)節(jié)因子3（interferon regulatory factor,IRF3）是誘導(dǎo)I 型IFN 所需的RIG-I 樣受體（RIG-Ⅰ-like receptors,RLRs）通路中的關(guān)鍵分子。TANK 結(jié)合激酶1（TANK-binding kinase 1,TBK1）與IRF3 相互作用可促進(jìn)IRF3 的磷酸化，進(jìn)而活化IRF3 誘導(dǎo)Ⅰ型IFN 的表達(dá)[19]。PPRV N 蛋白可抑制I 型IFN 和干擾素刺激基因（ISG）的表達(dá)，其分子機(jī)制為N 蛋白結(jié)合IRF3 后抑制TBK1 與其相互作用，進(jìn)而抑制IRF3 的磷酸化，阻斷Ⅰ型IFN信號(hào)通路[20]。進(jìn)一步證實(shí)PPRV N蛋白106-210 氨基酸區(qū)域是其抑制IFN 和ISG 的關(guān)鍵區(qū)域，而IRF3 的140-400 氨基酸區(qū)域是IRF3 與PPRV N 蛋白互作的關(guān)鍵區(qū)域[20]。與其相反，MV N 蛋白可通過誘導(dǎo)IRF3 的磷酸化，進(jìn)而激活I(lǐng)RF3 誘導(dǎo)I 型IFN 的表達(dá)，且這種相互作用發(fā)生在N 蛋白的376-523 氨基酸區(qū)域[21]。

目前，關(guān)于CDV 疫苗株和野毒株N、H 蛋白調(diào)控干擾素表達(dá)的研究鮮有報(bào)道。因此，本研究通過構(gòu)建表達(dá)CDV 疫苗株和野毒株的N、H 蛋白真核表達(dá)載體，初步探索不同毒力CDV 株N、H 蛋白對(duì)IFN- 表達(dá)的影響，可為后期研究CDV N、H 蛋白與宿主天然免疫分子的互作奠定基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 細(xì)胞、病毒和質(zhì)粒

人胚胎腎細(xì)胞293T（HEK293T）、犬腎小管上皮細(xì)胞（MDCK）；CDV 野毒株LN（10）1[22]、SD（14）7[23]和CDV 疫苗株CDV3[24]；真核表達(dá)載體pCI 和融合表達(dá)Flag 抗原標(biāo)簽的H 蛋白重組質(zhì)粒pCI-LN（10）1-H 和pCI-SD（14）7-H[22]均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所和黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)保存；Trans5感受態(tài)細(xì)胞購自上海生物工程有限公司；pGEM-T 載體購自Promega 公司；熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-IFN- 和海參熒光內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK 由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)曹鑫教授惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑

病毒RNA 提取試劑盒（Viral RNA Mini kit）購自QIAgen 公司；PrimeScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、In-Fusion同源重組試劑盒和Premix Taq 購自TaKaRa 公司；膠回收試劑盒、中提質(zhì)粒試劑盒購自O(shè)mega 公司；Cpo I 核酸內(nèi)切酶、高保真DNA聚合酶、蛋白Marker 和ECL 底物發(fā)光試劑盒均購自Thermo 公司；小提質(zhì)粒試劑盒購自全式金公司；Lipofectamine 3 000 轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen 公司；兔抗Flag 抗體購自Sigma 公司；CDV N 蛋白特異性單克隆抗體購自VMRD 公司；山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗購自生工生物工程（上海）股份有限公司；Dual-Luciferase 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)購自Promega 公司；RIPA 裂解液購于碧云天公司；Poly（I:C）購自InvivoGen 公司；Tris-MOPS-SDS Running Buffer Powder購自金斯瑞生物科技公司；轉(zhuǎn)膜液購自Biosharp 公司。

1.3 CDV 感染MDCK 細(xì)胞熒光素酶表達(dá)檢測

將MDCK 細(xì)胞鋪一個(gè)24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔約1 105個(gè)細(xì)胞，待其長至70%左右時(shí)，每孔轉(zhuǎn)染pGL3-IFN-報(bào)告基因質(zhì)粒（100 ng）和pRL-TK 內(nèi)參質(zhì)粒（10 ng），18 h后，分別將LN（10）1、SD（14）7 和CDV3 株按感染復(fù)數(shù)（MOI）0.1 感染MDCK 細(xì)胞，并設(shè)置病毒未感染組（Mock）對(duì)照，分別在感染0、8、12、24 h 后，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)板的液體，加入100L/孔1 Passive Lysis Buffer裂解細(xì)胞20 mi n，轉(zhuǎn)移裂解液至1.5 mL 離心管，12 000 r/min離心1 min。在1.5 mL離心管中加入20L 離心后的上清液，按照雙熒光素酶檢測試劑盒（名稱）說明書，應(yīng)用Promega Glo Max 發(fā)光檢測儀測定熒光值[10]。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中CDV 野毒株LN（10）1（登錄號(hào)：KP765764.1）、SD（14）7（登錄號(hào)：KP765763.1）和CDV疫苗株CDV3（登錄號(hào)：EU726268.1）基因序列，使用Oligo 軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增N 蛋白基因編碼區(qū)的特異性引物[25]；以疫苗株CDV 3 的基因序列為模板，根據(jù)In-Fusion 同源重組試劑盒說明書，設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增CDV3 H蛋白基因序列的特異性引物。具體引物信息見表1。引物由生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 擴(kuò)增CDV N 蛋白和H 蛋白基因引物序列Table 1 N and H gene Primer Sequence

1.5 CDV N、H蛋白基因克隆

使用Viral RNA Mini kit 提取病毒RNA，具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。以提取的病毒RNA 為模板，按照TaKaRa 公司的Prime ScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，應(yīng)用隨機(jī)引物進(jìn)行RNA 反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板，應(yīng)用表1 特異性引物進(jìn)行N 和H 基因PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系按照Roche 公司Expand High Fidelity PCR kit 說明書進(jìn)行，取全部PCR 反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收陽性目的片段。

1.6 CDV N、H蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建

將LN（10）1、SD（14）7 和CDV3 株N 基因PCR回收產(chǎn)物與pGEM-T 載體連接，經(jīng)酶切鑒定和測序，將克隆到pGEM-T 載體的目的片段與pCI 表達(dá)載體相連。重組陽性質(zhì)粒pCI-LN（10）1-N、pCI-SD（14）7-N和pCI-CDV3-N 經(jīng)酶切確認(rèn)后送測序；將CDV3 H 基因PCR 回收產(chǎn)物，根據(jù)In-Fusion 試劑盒說明書，將目的基因與pCI 載體連接并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，通過菌液PCR 鑒定，將陽性菌液測序確認(rèn)陽性重組質(zhì)粒pCICDV3-Hflag 基因序列正確。

1.7 CDV N、H蛋白真核表達(dá)載體的表達(dá)

待6 孔板中的HEK293T 細(xì)胞長至80%左右，根據(jù)Lipofectamine 3 000 轉(zhuǎn)染試劑說明書，將成功構(gòu)建的表達(dá)不同毒株N 蛋白和疫苗株H 蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)染量2g/孔，24 h 后，獲取細(xì)胞裂解上清液，SDS-PAGE 電泳后，轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5%的脫脂奶粉封閉2 h，分別孵育抗N 蛋白單克隆抗體和兔抗Flag抗體，常溫?fù)u床2 h或4℃過夜，用PBST洗3 次后，分別孵育山羊抗小鼠二抗和山羊抗兔二抗，常溫?fù)u床1 h，用PBST洗3 次，每次15 min，按照ECL超敏顯色液說明書，利用Tanon 化學(xué)發(fā)光成像儀曝光自顯影檢目的條帶。

1.8 CDV N、H蛋白對(duì)IFN- 表達(dá)的影響

消化HEK293T 細(xì)胞，鋪1 個(gè)24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔約1 105個(gè)細(xì)胞，待其密度長至70% 左右，每孔轉(zhuǎn)染pGL3-IFN- 報(bào)告基因質(zhì)粒（100 ng）和pRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒（10 ng），在此基礎(chǔ)上，每孔分別轉(zhuǎn)染500 ng不同毒株的N 或H 蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒或空載體表達(dá)質(zhì)粒（pCI），轉(zhuǎn)染12 h 后，參照Lipofectamine 3 000 說明書轉(zhuǎn)染Poly（I:C）刺激細(xì)胞，其中未受刺激的pCI 組作為陰性對(duì)照，受刺激的pCI 組作為陽性對(duì)照，12 h后，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)板的液體，加入100L/孔1 Passive Lysis Buffer 裂解細(xì)胞20 min，轉(zhuǎn)移裂解液至1.5 mL離心管，12 000 r/min 離心1 min。在1.5 mL 離心管中加入20L 離心后的上清液，按照雙熒光素酶檢測試劑盒說明書，利用Promega Glo Max 發(fā)光檢測儀測定熒光值[10]。相對(duì)熒光素酶活性值是螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05 代表差異顯著（*），P ＜0.01 代表差異極顯著（**），P ＞0.05代表差異不顯著（NS）。

2 結(jié)果

2.1 CDV 感染MDCK 細(xì)胞誘導(dǎo)IFN- 啟動(dòng)子的活性結(jié)果

轉(zhuǎn)染pGL3-IFN- 報(bào)告基因質(zhì)粒和pRL-TK 內(nèi)參質(zhì)粒，12 h 后，將LN（10）1、SD（14）7 和CDV3 分別感染MDCK 細(xì)胞，在感染后不同時(shí)間點(diǎn)檢測熒光素酶的相對(duì)活性。結(jié)果顯示疫苗株CDV3 在感染MDCK 后8 h，IFN- 啟動(dòng)子的活性有所上升，但隨后又降低到背景水平，而野毒株LN（10）1 和SD（14）7 均未能誘導(dǎo)IFN- 啟動(dòng)子的活性，結(jié)果如圖1。

圖1 不同毒力CDV 感染MDCK 后不同時(shí)間IFN- 表達(dá)結(jié)果Fig.1 IFN- induction during the infection with different strains of CDV

2.2 CDV N、H 基因分子克隆結(jié)果

分別使用N 和H 基因的特異性引物擴(kuò)增出目的片段，瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)顯示結(jié)果如圖2 所示，擴(kuò)增產(chǎn)物N 和H 大小分別為1 572 bp 和1 824 bp，與預(yù)期大小一致。將LN（10）1、SD（14）7 和CDV3 株N和H 基因克隆到pCI載體，通過酶切和測序證實(shí)pCI-N和pCI-H 重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 N 和H 基因目的片段的擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification products of the CDV N and H gene

2.3 CDV N、H蛋白的表達(dá)結(jié)果

將表達(dá)CDV N 和H 基因的重組質(zhì)粒pCI-N 和pCI-H 分別轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，24 h 后獲取細(xì)胞裂解液上清，利用Western blot 對(duì)其表達(dá)情況進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果如圖3 所示，N 蛋白大小約為56 kDa，融合表達(dá)Flag 抗原標(biāo)簽的H 蛋白大小約為110 kDa，表明各真核表達(dá)載體在HEK293T 細(xì)胞中正確表達(dá)，其中pCI-LN（10）1-H 及pCI-SD（14）7-H 真核表達(dá)載體之前已由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建完成并可正常表達(dá)[22]。

圖3 N 和H 重組質(zhì)粒的表達(dá)Fig.3 The expression of N and H recombinant plasmids

2.4 CDV N、H蛋白對(duì)-干擾素表達(dá)的影響

在HEK293T 細(xì)胞中過表達(dá)不同毒株CDV N 蛋白，12 h 后用Poly（I:C）刺激細(xì)胞，利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測試劑盒檢測IFN- 啟動(dòng)子的活性，結(jié)果如圖4A 所示，陽性對(duì)照組IFN- 啟動(dòng)子的相對(duì)活性為20.89，極顯著高于陰性對(duì)照組（P ＜0.01），表明Poly（I:C）成功激活I(lǐng)FN- 信號(hào)通路；而這種激活作用在過表達(dá)不同毒力的N 蛋白時(shí)極顯著受到抑制（P ＜0.01），pCI-LN（10）1-N、pCI-SD（14）7-N 和pCI-CDV3-N 實(shí)驗(yàn)組IFN- 啟動(dòng)子的相對(duì)活性分別為3.98、4.10 和8.32。同樣方法在HEK293T 細(xì)胞中過表達(dá)不同毒株CDV H 蛋白，結(jié)果如圖4B 所示，Poly（I:C）成功激活I(lǐng)FN信號(hào)通路，陽性對(duì)照組IFN- 啟動(dòng)子的相對(duì)活性為26.22，pCI-LN（10）1-H、pCI-SD（14）7-H 和pCI-CDV3-H實(shí)驗(yàn)組的IFN- 啟動(dòng)子的相對(duì)活性分別為5.28、5.70和6.79，極顯著低于陽性對(duì)照組，說明不同毒力H 蛋白的過表達(dá)極顯著抑制IFN- 通路的激活作用。

圖4 不同CDV 毒株N、H 蛋白抑制IFN- 啟動(dòng)子的激活Fig.4 N and H protein of different strains suppresses IFN- promoter activation

3 討論

在病原微生物入侵以后，宿主通過多種細(xì)胞模式識(shí)別受體（Pattern Recognition Receptors, PRRs）識(shí)別病原代謝過程中產(chǎn)生的保守組分病原相關(guān)分子模式（Pathogen-associated Molecular Pattern,PAMPs），經(jīng)由不同的接頭分子，活化多條信號(hào)通路，誘導(dǎo)炎性因子及IFN 的產(chǎn)生，以對(duì)抗病原微生物的感染，RLRs 是經(jīng)典的PRRs[13]。然而，大多數(shù)麻疹病毒屬成員進(jìn)化出多種對(duì)抗宿主免疫系統(tǒng)的策略：一是病毒蛋白通過干擾RLRs等介導(dǎo)的IFN 上游信號(hào)通路的激活來抑制IFN 的表達(dá)，大部分RPV、MV、CDV 和PPRV 都能拮抗I型IFN的產(chǎn)生[26-28]；二是病毒蛋白通過干擾IFN 下游信號(hào)通路的激活來抑制眾多抗病毒蛋白的產(chǎn)生[27-29]，如MVV蛋白通過與STAT1/2 結(jié)合，阻止STAT 蛋白向細(xì)胞核遷移，抑制IFN 誘導(dǎo)抗病毒因子的表達(dá)[8]；同樣，CDV V蛋白的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域（N 端和C 端）選擇性地抑制了STAT1 和STAT2 入核[30]，進(jìn)而阻斷了IFN 誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗病毒蛋白的信號(hào)通路。

為進(jìn)一步在分子水平理解CDV 誘導(dǎo)宿主的免疫抑制機(jī)制，本研究通過不同病毒株感染MDCK 細(xì)胞和表達(dá)不同CDV 毒株H 和N 蛋白，研究其對(duì)IFN- 信號(hào)通路的調(diào)控作用。CDV 野毒株SD（14）7 和LN（10）1分離自2014 年和2010 年CD發(fā)病死亡狐貍。與LN（10）1株相比，SD（14）7 株H 蛋白多處氨基酸發(fā)生變異，引起CDV 對(duì)水貂、狐貍的毒力和免疫抑制增強(qiáng)[22]。CDV3 疫苗株為我國毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖場使用的CDV 疫苗株, 能較好地預(yù)防CD 的暴發(fā)流行。MDCK 細(xì)胞為CDV 易感宿主細(xì)胞，在病原微生物入侵時(shí)，可迅速產(chǎn)生包括IFN 在內(nèi)的抗病毒因子[31]，因此，本研究選擇MDCK 細(xì)胞作為CDV 體外感染靶細(xì)胞。研究結(jié)果證實(shí)，疫苗株和野毒株CDV 感染MDCK 細(xì)胞后，只有疫苗株能引起IFN- 啟動(dòng)子的短暫激活，而野毒株在感染MDCK 細(xì)胞24 h 內(nèi)，IFN- 啟動(dòng)子未激活，說明CDV 在感染MDCK 細(xì)胞后，可能是抑制了IFN- 的表達(dá)，與后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合。Takayama 等[32]研究發(fā)現(xiàn)MV N 蛋白既不抑制STAT 和Jak 磷酸化也不引起STAT 降解，但N 蛋白的核移位干擾了STATs 入核，從而阻斷IFN 的信號(hào)通路。Takayama 等[32]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在IFN-和IFN-刺激下，CDV N 蛋白同樣具有抑制IFN-和IFN-下游信號(hào)通路激活，即抑制IFN誘導(dǎo)抗病毒蛋白產(chǎn)生。本研究結(jié)果顯示，CDV N 和H蛋白均可下調(diào)Poly（I:C）誘導(dǎo)IFN- 啟動(dòng)子的活性，說明CDV N 和H 蛋白可通過干擾IFN- 信號(hào)通路來抑制IFN- 表達(dá)。Fontana 等[9]通過研究MV 疫苗株和野毒株C 和V 蛋白對(duì)IFN 調(diào)控的影響發(fā)現(xiàn)，V 蛋白比C 蛋白對(duì)IFN 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有更強(qiáng)的抑制作用，且這種抑制作用與MV 的毒力無關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果也顯示CDV N 或H 蛋白下調(diào)IFN- 的表達(dá)與CDV 毒力無關(guān)，說明不同毒力的CDV N 或H 蛋白均可入侵宿主并可能與IFN- 信號(hào)通路中多個(gè)蛋白互作，但具體分子通路還有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)通過研究疫苗株和野毒株N 和H 蛋白對(duì)IFN- 表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)N 和H 蛋白抑制宿主天然免疫與CDV 毒力無關(guān)。未來將構(gòu)建表達(dá)N 和H 蛋白截短體，進(jìn)一步研究病毒蛋白抑制IFN 表達(dá)的關(guān)鍵氨基酸區(qū)域，有助于進(jìn)一步理解CDV 基于分子水平的致病機(jī)制，為開發(fā)新型抗CDV 藥物提供一定的理論依據(jù)。