黃文祺，蔡崢，周華

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 老年病科，上海 201203)

心肌纖維化是長期高血壓導(dǎo)致的一種心肌組織病理學(xué)改變，心肌細胞肥大、心肌成纖維細胞的過度增殖以及膠原的大量沉積是高血壓心肌纖維化的主要病理特征[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)，腹主動脈縮窄術(shù)(constriction of abdominal aorta，AAC)是誘導(dǎo)高血壓大鼠的一種經(jīng)典的模型[2]?；A(chǔ)和臨床資料證實，高血壓進程中會出現(xiàn)心肌僵硬增加，導(dǎo)致心肌活動受限，心室順應(yīng)性降低，最終誘發(fā)心肌的收縮與舒張功能的異常[3-5]。以上臨床表現(xiàn)與心肌纖維化的進展密切相關(guān)，嚴重者可以導(dǎo)致高血壓心臟病損害。因此，積極尋找有效的藥物對治療高血壓心肌纖維化十分重要。白藜蘆醇(resveratrol，RES)是一種存在葡萄皮、漿果等多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化以及抗纖維化等作用[6]。研究表明，RES能夠通過下調(diào)TGF-β1/Smads信號通路抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細胞增殖和分化，減輕心肌纖維化程度[7]。在阿奇霉素誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化模型中，RES能夠上調(diào)沉默信息調(diào)節(jié)因子3(sirtuin 3，SIRT3)降低阿奇霉素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激水平、抑制心肌組織炎癥細胞因子表達進而提高抗心肌纖維化能力[8]。以上研究表明，在多種心肌纖維化模型中RES能夠有效的抑制心肌纖維化進程，改善心肌功能。但是有關(guān)RES對ACC誘導(dǎo)的高血壓心肌纖維化的作用機制尚不完全清楚。因此，本研究擬通過構(gòu)建高血壓心肌纖維化動物模型，探究RES對心肌纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 雄性、無特定病原體(specific pathogen free，SPF)感染、周齡6～8周以及體質(zhì)量(body weight，BW)為(200±20)g的斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?sprague dawley，SD)大鼠購買于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動物學(xué)部[SCXK(湘)2017-0011]，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。飼養(yǎng)條件：晝夜交替，溫度25 ℃，相對濕度70%。

1.1.2藥品與試劑 RES(批號R5010-100MG，美國sigma公司，純度≥99%)、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)公司，貨號C0105S)、馬松(Masson)染色試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)公司，貨號C0110)、膠原蛋白Ⅲ(Collagen Ⅲ)抗體(Abcam公司，貨號ab7778)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)抗體(Abcam公司，貨號ab215715)、C1q/腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白6(CTRP6)抗體(Abcam公司，貨號ab36900)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(江蘇碧云天生物技術(shù)公司，貨號AF5009)、小鼠二抗(江蘇碧云天生物技術(shù)公司，貨號A0286)、兔二抗(江蘇碧云天生物技術(shù)公司，貨號A0277)、一抗和二抗稀釋液(江蘇碧云天生物技術(shù)公司，貨號P0025S)以及極超敏ECL發(fā)光試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)公司，貨號P0018S)。

1.1.3主要儀器 G22-W型高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器有限公司)、SuPerMax 3000FA型多功能酶標儀(Thermo賽默飛世爾)、M371450型組織渦旋儀(武漢維塞爾生物科技有限公司)、TC-XDS-500C型熒光倒置顯微鏡(日本/奧林巴斯Olympus)、Western blotting檢測裝置(美國Bio-Rad伯樂公司)以及GoodLook-1000型成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad伯樂公司)。

1.2 方法

1.2.1模型構(gòu)建與分組 30只SD大鼠隨機 分為假手術(shù)組(Sham組)、模型組(Model組)和RES治療組(RES組)。其中Model組采用ACC法構(gòu)建大鼠高血壓心肌纖維化。造模按照3 mL/kg劑量腹腔注射水合氯醛(100 g/L)麻醉大鼠、腹中線周圍皮膚消毒，沿腹中線縱向切開皮膚，分離皮下組織，暴露腹主動脈；Model組和RES組在有腎動脈分支約0.5 cm處按照文獻[9]方法進行ACC術(shù)，Sham組僅穿線不結(jié)扎。在造模成功之后，RES組給予劑量為10 mg/(kg·d)的RES灌胃7 d，Model組和sham組給予等量的生理鹽水灌胃7 d。

1.2.2尾動脈收縮壓(systolic blood pressure，SBP)和左心室體質(zhì)量指數(shù)(left ventricular mass index，LVMI)測定 造模28 d后，尾套法測定SBP，電子稱稱量大鼠BW，打開大鼠胸腔取出心臟，并分離左心室稱重(left ventricular mass，LVM)，計算LVMI=LVM/BW。

1.2.3HE染色檢測心肌形態(tài)、Masson染色觀察心肌纖維 采用4%的多聚甲醛固定各組大鼠心尖組織，石蠟切片，并按照HE染色試劑盒進行心尖組織染色。按照Masson染色試劑盒步驟進行心尖間質(zhì)膠原染色，染色后肌纖維呈現(xiàn)紅色，膠原纖維呈現(xiàn)藍色。

1.2.4Western blot檢測心尖組織Collagen Ⅲ、TGF-β1和CTRP6蛋白表達 取各組大鼠的心尖組織放置于組織研磨管內(nèi)，按照1 ∶4的比例加入組織裂解液并放置于冰上裂解40 min，期間每間隔5 min進行組織渦旋振蕩保證裂解完全，將裂解后的離心管放置于離心機內(nèi)，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，得到組織上清液。二辛喹酸(bicinchoninic acid，BCA)法測定蛋白質(zhì)濃度，按照35 μg/孔上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，孵育Collagen Ⅲ一抗(1 ∶1 000)、TGF-β1一抗(1 ∶1 000)以及CTRP6一抗(1 ∶500)4 ℃過夜，洗膜，孵育對應(yīng)的二抗室溫孵育60 min，TBST洗膜5 min×3次，加入顯影液，顯影并拍照。圖片掃描后用Image J 軟件計算各條帶的灰度值，并以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 RES對高血壓大鼠心肌結(jié)構(gòu)的影響

3組大鼠BW比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與sham組相比，Model組SBP和LVMI明顯升高(P<0.01)；與Model組相比，RES組SBP和LVMI降低(P<0.05或P<0.01)。HE染色顯示，Sham組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)正常，心肌纖維排列規(guī)則；Model組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂，心肌纖維排列不規(guī)則，有明顯水腫現(xiàn)象；RES組大鼠心肌纖維排列相對規(guī)則，有少許水腫現(xiàn)象。見圖1、表1。

表1 各組大鼠BW、SBP和LVMI比較 Tab.1 Measurement results of BW,SBP,and LVMI of rats in each group

注：箭頭表示心肌水腫。圖1 觀察3組大鼠心肌形態(tài)變化(HE,×200)Fig.1 The morphological changes of rat myocardium in three groups(HE,×200)

2.2 RES對高血壓大鼠心肌纖維化的影響

與Sham組相比，Model組大鼠心肌組織間質(zhì)有大量膠原沉積；與Model組相比，RES組大鼠心肌間質(zhì)膠原沉積減少。Western blot檢測顯示，與Sham組相比，Model組大鼠心肌組織Collagen Ⅲ和TGF-β1表達顯著升高(P<0.01);與Model組相比，RES組大鼠心肌組織Collagen Ⅲ和TGF-β1表達降低(P<0.05或P<0.01)。見圖2、圖3。

注：箭頭表示心肌膠原沉積。圖2 3組大鼠心肌纖維化情況(Masson,×200)Fig.2 Masson staining to observe myocardial fibrosis in each group of rats(Masson,×200)

注：(1)與sham組相比，P<0.01；與Model組相比，(2)P<0.05，(3)P<0.01。圖3 各組大鼠Collagen Ⅲ和TGF-β1蛋白表達Fig.3 Collagen Ⅲ and TGF-β1 protein expression in each group of rats

2.3 RES對CTRP6蛋白表達的影響

結(jié)果顯示，與Sham組相比，Model組大鼠心尖組織CTRP6表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與Model組相比，RES組大鼠心尖組織CTRP6表達顯著升高差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

注：(1)與sham組相比，P<0.01；(2)與Model組相比，P<0.05。圖4 各組大鼠CTRP6蛋白表達Fig.4 CTRP6 protein expression in each group of rats

3 討論

RES是一種從中藥材提取出來的抗毒素，近年來有關(guān)RES在心血管疾病中發(fā)揮重要作用?；A(chǔ)和臨床研究資料表明，RES能夠降低心肌氧化應(yīng)激水平，抑制細胞凋亡和炎癥反應(yīng)進而改善高血壓合并心肌纖維化[10-13]。本研究首先通過ACC復(fù)制高血壓大鼠模型，與Sham組比較，ACC復(fù)制模型組SBP和LVMI均顯著升高，表明高血壓大鼠模型建立成功。為探究RES對高血壓大鼠的影響，RES組大鼠給予劑量為10 mg/(kg·d)的RES灌胃7 d。結(jié)果顯示，與Model組相比，RES能夠有效降低SBP和LVMI。心肌纖維化是高血壓合并心臟病的重要病理學(xué)改變，通過有效抑制心肌纖維化對降低高血壓心臟病具有重要意義。既往研究發(fā)現(xiàn)，吡格列酮可以通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(metalloproteinases，MMPs)/基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)平衡促進膠原降解，進而抑制膠原沉積和心肌纖維化進程，其作用機制可能與抑制心肌組織活性氧產(chǎn)生相關(guān)[10]。另外，淫羊藿次苷Ⅱ能夠下調(diào)MMP-2、MMP-9和TIMP-1，改善自發(fā)性高血壓大鼠心肌的纖維化情況[14]。RES能夠抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠心臟成纖維細胞膠原的合成，其機制可能與降低Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ及TGF-β1的蛋白表達相關(guān)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，Model組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂，心肌纖維排列不規(guī)則，有明顯水腫現(xiàn)象。RES組大鼠心肌纖維排列相對規(guī)則，有少許水腫現(xiàn)象。Masson染色顯示，與Model組相比，RES組大鼠心肌間質(zhì)膠原沉積減少。進一步研究，Model組大鼠給予RES灌胃處理7 d后，心肌組織Collagen Ⅲ和TGF-β1表達均顯著降低。以上研究結(jié)果表明，RES能夠抗ACC誘導(dǎo)的高血壓大鼠心肌纖維化。但是，目前有關(guān)RES對高血壓心肌纖維化的作用機制尚不完全清楚。

C1q/腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白6(C1/qtumor necrosis factor-related protein 6，CTRP6)是一種脂肪因子蛋白超家族成員之一，在胎盤、腎臟、心臟等組織中廣泛表達[16-18]。有研究報道，CTRP6與多種疾病狀態(tài)的炎癥反應(yīng)與纖維化密切相關(guān)[19-22]。新近研究證實，在大鼠心肌梗死模型中，心肌組織CTRP6表達顯著降低，過表達CTRP6能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化[23]。在糖尿病心肌病大鼠模型中心肌組織CTRP6表達顯著降低，在給予阿司匹林灌胃后心肌組織CTRP6表達顯著升高，心肌纖維化程度得到明顯改善[24]。以上研究表明，CTRP6能夠抑制心肌纖維化過程，發(fā)揮心肌保護作用。為此，本研究探究RES能否通過CTRP6抑制高血壓大鼠心肌纖維化。與Sham組相比，Model組大鼠心肌組織CTRP6表達顯著降低。在給予RES灌胃處理7 d后心肌組織CTR6表達顯著升高。以上結(jié)果初步證實，RES對高血壓心肌纖維化的保護作用可能與促進CTRP6表達有關(guān)。

綜上所述，本研究通過探究RES對ACC誘導(dǎo)的高血壓大鼠模型，發(fā)現(xiàn)RES能夠抗高血壓心肌纖維化，其作用機制可能與上調(diào)CTRP6表達相關(guān)，但是有關(guān)CTRP6在RES抑制高血壓心肌纖維化的具體分子機制需要進一步探究。因此，在后續(xù)研究中將通過過表達或敲除CTRP6細胞和動物的實驗驗證RES對其調(diào)控的機制。