[摘要]"目的"探討抗生素短期干預(yù)所致腸道菌群紊亂對大鼠食欲和糖脂代謝的影響。方法"聯(lián)合使用氨芐西林、新霉素、甲硝唑干預(yù)大鼠的腸道菌群，利用高通量測序技術(shù)，分析抗生素對大鼠腸道菌群的干預(yù)情況。通過連續(xù)監(jiān)測大鼠的進食和進水量、尿量、體質(zhì)量、血糖和血脂，分析腸道菌群被干預(yù)大鼠的食欲及糖脂代謝變化。結(jié)果"抗生素干預(yù)了大鼠的腸道菌群，而腸道菌群紊亂大鼠的進食和進水量、尿量顯著增高（t=3.95～7.54，P<0.05），但其體質(zhì)量、血糖和血脂無顯著變化（t=0.05～1.89，P>0.05）。結(jié)論"抗生素短期干預(yù)所致腸道菌群紊亂影響了大鼠的食欲，而大鼠的體質(zhì)量、糖脂代謝未受影響。

[關(guān)鍵詞]"胃腸道微生物組;抗菌藥;食欲;碳水化合物代謝;脂類代謝;大鼠

[中圖分類號]"R378.2

[文獻標志碼]"A

[文章編號]"2096-5532（2021）04-0498-05

近年來，越來越多的人出現(xiàn)肥胖和飲食失調(diào)癥狀[1-2]，這無疑反映了人們對食欲紊亂的原因認識不足以及對其缺乏有效的治療[3-4]，因此，探究影響宿主食欲調(diào)節(jié)的因素，是治療肥胖、厭食癥、暴食癥和惡病質(zhì)等食欲紊亂性疾病的重中之重[5-8]。眾所周知，人體腸道寄居著數(shù)萬億的微生物[9]，而這些微生物可以通過與宿主的相互作用和共同的代謝活動影響宿主的生理功能和病理生理，因此腸道微生物在人類的健康和疾病中扮演著重要角色[10-11]。有研究顯示，肥胖、厭食癥和暴食癥病人的腸道微生物群發(fā)生改變，提示腸道菌群與宿主的食欲調(diào)節(jié)及代謝之間有潛在聯(lián)系[12-14]。本研究通過聯(lián)合使用抗生素干預(yù)大鼠的腸道菌群，進而觀察腸道菌群紊亂大鼠的食欲變化以及糖脂代謝情況，探討腸道菌群對宿主的食欲調(diào)節(jié)和代謝的影響，以推動針對食欲紊亂性疾病的新型診斷和治療方法的出現(xiàn)。

1"材料與方法

1.1"材料

雄性6周齡Wistar大鼠20只，購自青島琴大生物科技有限公司，飼養(yǎng)于青島大學附屬醫(yī)院SPF級動物房內(nèi)。動物實驗經(jīng)青島大學附屬醫(yī)院動物研究倫理委員會批準（AHQU-MAL2017022）。氨芐西林、青霉素、甲硝唑購自生工生物工程（上海）股份有限公司。E.Z.N.A Soil DNA試劑盒（OMEGA），AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN），ABI GeneAmp 9700 型PCR儀，德國羅氏卓越血糖儀，全自動生化分析儀（TOSHIBA，Japan），大鼠代謝籠，大鼠灌胃針。

1.2"動物分組和處理

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將20只大鼠隨機分為正常組（C組）和抗生素組（A組），每組10只。參照文獻方法并適當改進[15]，A組大鼠喂以正常飼料，并稱取一定劑量的抗生素（氨芐西林250 mg/kg、新霉素250 mg/kg、甲硝唑50 mg/kg），用無菌水溶解（混合溶液濃度為50 g/L）后每天灌胃1次，"連續(xù)灌胃5周;C組大鼠喂以正常飼料，每天以等體積的無菌水灌胃1次，連續(xù)灌胃5周。每周六記錄1次大鼠體質(zhì)量，每周日記錄1次大鼠的24 h進食量、進水量以及尿量，每周一檢測1次大鼠的血糖和血脂。

1.3"大鼠進食量、進水量、尿量檢測

每個大鼠代謝籠飼養(yǎng)1只大鼠，將相同質(zhì)量的大鼠飼料、相同體積的無菌水以及干凈的尿杯分配給每只大鼠，24 h后，再次稱量每只大鼠的剩余飼料，用量筒或1 000 mL的移液槍分別量取每只大鼠的進水量和尿量，以此分析大鼠的食欲情況。

1.4"大鼠糞便樣本的收集

在抗生素使用前（0周）和抗生素使用3周后（3周）分別收集大鼠的新鮮糞便。用碘附擦拭大鼠肛門后，將大鼠放于無菌報紙上，用手按摩大鼠屁股，以無菌鑷子夾取大鼠肛門處新鮮糞便置于無菌冷凍管中，并立即暫存于液氮罐中，之后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱以供腸道菌群測序。

1.5"454焦磷酸測序

1.5.1"糞便DNA提取和PCR擴增"每只大鼠取50～100 mg糞便，使用E.Z.N.A Soil DNA試劑盒抽提糞便的基因組DNA，之后應(yīng)用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的DNA;利用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和533R（5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′）在ABI GeneAmp 9700型PCR儀中擴增16S rDNA的V1～V3高變區(qū)，擴增產(chǎn)物用20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物。

1.5.2"測序及生物信息學分析"回收的PCR產(chǎn)物用羅氏GS-FLX 454焦磷酸測序系統(tǒng)進行測序，為保證序列的質(zhì)量，分析前先對原始數(shù)據(jù)進行過濾處理，得到優(yōu)化序列。排除標準如下：①引物的錯配數(shù)大于2的序列;②長度短于250 bp、模糊堿基數(shù)大于0、序列平均質(zhì)量低于 25的序列;③未測通目標區(qū)域的序列。其次，將優(yōu)化的序列按照97%的相似性分歸為許多個操作分類單元（OTU），進行生物信息統(tǒng)計分析。將每條優(yōu)化序列均與SILVA（SSU111版）的小亞基核糖體RNA（SSUrRNA）數(shù)據(jù)庫進行比對，找出其最相近且可信度達80%以上的種屬信息。為獲得每個OTU的分類學信息，將97%相似水平下每個OTU中的所有序列進行一致性分析，找出同一個OTU中不同序列的最近祖先的種屬信息作為該OTU的種屬信息。

1.6"血清生化指標的檢測

采集靜脈血之前，大鼠禁食8～10 h。于每周一早晨，采用剪尾取血法取血，用血糖儀檢測大鼠的空腹血糖（BG）濃度;采用內(nèi)眥取血法采集大鼠的空腹靜脈血，以3 000 r/min離心10 min，吸取血清，使用全自動生化分析儀檢測血清中三酰甘油（TG）和膽固醇（CHOL）的濃度。

1.7"統(tǒng)計學分析

應(yīng)用GraphPad Prism軟件繪圖，SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料結(jié)果以X2±s表示，數(shù)據(jù)間的比較采用析因設(shè)計的方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2"結(jié)"果

2.1"抗生素對大鼠腸道菌群的影響

抗生素的使用顯著降低了大鼠的腸道菌種數(shù)目（t=9.15，P<0.01）。見表1。在門水平分析大鼠的腸道菌群組成，結(jié)果顯示，抗生素干預(yù)了大部分的腸道菌門，即Elusimicrobia、Cyanobacteria、Proteobacteria、Firmicutes、Verrucomicrobia 和Bacteroidetes的相對豐度都發(fā)生顯著變化（t=2.53～12.97，P<0.05）。見表2。大鼠糞便菌種數(shù)目的急劇降低以及腸道菌群相對豐度的顯著改變表明，抗生素使大鼠的腸道菌群受到嚴重干預(yù)。

2.2"腸道菌群紊亂大鼠的食欲變化

在整個實驗過程中，C組大鼠的進食量、進水量和尿量始終保持穩(wěn)定。而在抗生素處理1周后，A組大鼠的進食量、進水量和尿量開始顯著升高，并一直維持至第5周?？股靥幚砗?～5周，A組大鼠的進食量、進水量和尿量始終高于C組（t=3.95～7.54，P<0.05）。提示抗生素短期干預(yù)所致的腸道菌群紊亂影響了大鼠的食欲，腸道菌群在大鼠的食欲調(diào)節(jié)中起著潛在作用。見圖1。

2.3"腸道菌群紊亂大鼠的體質(zhì)量變化

C組和A組大鼠的體質(zhì)量均呈現(xiàn)出增高趨勢，在整個實驗過程中，兩組大鼠的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義（t=0.36～1.68，P>0.05）。見圖1。

2.4"腸道菌群紊亂大鼠的糖脂代謝變化

C組和A組大鼠的血糖、血脂始終同向波動，并且在整個實驗過程中，兩組大鼠的血糖、血脂差異均無顯著性（t=0.05～1.89，P>0.05）。見圖2。

3"討"論

健康的腸道微生物群對宿主正常的代謝過程和微生態(tài)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，而腸道微生物組成的改變，可能通過影響宿主的新陳代謝而導(dǎo)致肥胖、糖尿病等[16-17]。過度使用抗生素，可以對腸道微生物群產(chǎn)生重大影響，導(dǎo)致其組成和功能的改變[18-20]，而微生物組成和功能的改變，又可能誘發(fā)各種內(nèi)分泌、代謝性、免疫性疾病[21-23]。本研究參考相關(guān)文獻的實驗方法并加以適當改進[15]，聯(lián)合使用氨芐西林、新霉素和甲硝唑干預(yù)大鼠的腸道菌群，通過對大鼠進食量、進水量、尿量、體質(zhì)量以及血糖、血脂的監(jiān)測，來分析腸道菌群紊亂大鼠的進食和代謝情況，進而探討腸道菌群對宿主食欲和代謝的影響。

本研究結(jié)果顯示，腸道菌群紊亂大鼠的進食量和進水量發(fā)生了顯著變化，說明腸道菌群可能在宿主的食欲調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。有研究表明，腸道菌群的改變可以導(dǎo)致炎性細胞因子的增加，這些細胞因子又會通過致炎癥作用參與代謝疾?。ㄈ绶逝趾?型糖尿病）和中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的精神性疾病（如認知障礙、焦慮和抑郁）的發(fā)生[17，24]，而包括焦慮和抑郁等在內(nèi)的精神性疾病明顯影響著宿主的食欲[25]。因此，腸道菌群或許通過炎性細胞因子或其代謝產(chǎn)物參與調(diào)節(jié)宿主的食欲，而進一步篩選出與食欲調(diào)節(jié)有關(guān)的腸道菌種，將推動食欲紊亂性疾病的新型診斷與治療。另外有研究表明，盡管沒有任何腸道菌群的無菌小鼠的進食量大于正常小鼠，但其體質(zhì)量并不會比正常小鼠更大[26]。同樣，本研究結(jié)果顯示，食欲提高大鼠的體質(zhì)量與正常大鼠相比并無顯著變化，這意味著腸道菌群在宿主的能量平衡中起著重要作用。

近年來，大量的研究表明，腸道菌群與宿主糖尿病和脂代謝紊亂性疾病之間有著密切聯(lián)系[26-27]。然而，本研究并沒有觀察到腸道菌群紊亂大鼠的異常的血糖和血脂濃度，但這并不能說明腸道菌群與糖脂代謝沒有關(guān)系，因為有研究發(fā)現(xiàn)，紊亂的腸道菌群不能改變正常飲食大鼠的脂代謝，卻可以加劇高膽固醇飲食大鼠的血脂積累[15]。這些結(jié)果提示，紊亂的腸道菌群尚不能作為單獨的影響因素驅(qū)動正常宿主的代謝變化。因此，有效的飲食控制和保持腸道微生物的穩(wěn)態(tài)將有望用來預(yù)防和治療糖脂代謝紊亂性疾病。

然而，本次研究僅對大鼠的腸道菌群進行了短期干預(yù)，進而對大鼠的食欲、體質(zhì)量和糖脂代謝情況連續(xù)監(jiān)測了5周，其結(jié)果僅代表抗生素短期干預(yù)所致腸道菌群紊亂對大鼠食欲和糖脂代謝的影響。在接下來的研究中，我們計劃將抗生素組大鼠的糞便菌群移植給無菌大鼠，進而觀測無菌大鼠的食欲、糖脂代謝變化或者對比分析兩組大鼠的腸道菌群代謝產(chǎn)物[28-30]，然后將變化的菌群代謝產(chǎn)物與食欲調(diào)節(jié)、糖脂代謝相關(guān)的信號通路聯(lián)系起來[31-32]，以此驗證腸道菌群在食欲變化、糖脂代謝中的潛在作用。

綜上所述，本研究利用抗生素干預(yù)了大鼠的腸道菌群，發(fā)現(xiàn)腸道菌群紊亂大鼠的進食量、進水量和尿量顯著增高，表明腸道菌群可能參與調(diào)節(jié)宿主食欲，但對正常大鼠的糖脂代謝沒有明顯影響。這些結(jié)果為開發(fā)肥胖、厭食癥、暴食癥和惡病質(zhì)等食欲紊亂性疾病的新型診斷和治療方法帶來了希望。

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（本文編輯"馬偉平）