丁雪粉,張德芳，呂海淼,彭 展,閆琛博,楊德新,王新莊* (.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450000；.河南省科技信息研究院，河南 鄭州 450000)

在體外特定的培養(yǎng)條件下，兔原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells,PGCs)可以重編程為生殖干細(xì)胞(embryonic germ cells,EGCs)，EGCs具有和胚胎干細(xì)胞(embryonic stem,ES)相似的生物學(xué)特性，為再生醫(yī)學(xué)的研究提供合適的種子細(xì)胞[1]。在體外，培養(yǎng)液中加入特定的誘導(dǎo)因子，PGCs可以定向分化為成熟的生殖細(xì)胞，這方面的研究在生殖生物學(xué)上有著舉足輕重的地位[2]。PGCs在體外培養(yǎng)過程中很容易發(fā)生凋亡和分化，因此需要對PGCs的體外培養(yǎng)條件進(jìn)行探索和優(yōu)化，以促進(jìn)PGCs轉(zhuǎn)分化為EGCs，并阻止其分化和凋亡。有很多學(xué)者探索PGCs的體外培養(yǎng)條件，這對大規(guī)模培養(yǎng)PGCs非常有意義。本研究以胎兔為研究對象，比較了胎齡、血清(fetal bovine serum,FBS)、血清替代物(knockout serum replacement,KSR)、維甲酸(retinoic acid，RA)、福司柯林(forskolin，F(xiàn)K)和三苯氧胺(4-hydroxytamoxifen，4OHT)等因素對PGCs分離培養(yǎng)的影響，并探究其生物學(xué)特性，完善兔PGCs體外分離培養(yǎng)條件，為下一步的建系工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物6月齡以上日本大耳白兔購自河南省實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 主要試劑H-DMEM干粉培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、非必需氨基酸(NEAA)和Knockout-DMEM購自Gibco公司；FK、4OHT、RA和轉(zhuǎn)鐵蛋白和白血病抑制因子(LIF)購自北京索萊寶科技有限公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Maker等購自TaKaRa公司。

1.3 PGCs基礎(chǔ)培養(yǎng)液的配制PGCs基礎(chǔ)培養(yǎng)液的配制方法詳見表1。

表1 PGCs基礎(chǔ)培養(yǎng)液的配制

1.4 不同成份PGCs培養(yǎng)液的配置基礎(chǔ)培養(yǎng)液標(biāo)記為A培養(yǎng)液；在A中加入3 μmol/L RA，記為B培養(yǎng)液；在A中加入100 nmol/L 4OHT，記為C培養(yǎng)液；在A中加入20 μmol/L FK，記為D培養(yǎng)液；在A中加入3 μmol/L RA和20 μmol/L FK，記為E培養(yǎng)液；在A中加入3 μmol/L RA和100 nmol/L 4OHT，記為F培養(yǎng)液；在A中加入100 nmol/L 4OHT和20 μmol/L FK，記為G培養(yǎng)液；在A中同時加入100 nmol/L 4OHT、20 μmol/L FK和3 μmol/L RA，記為H培養(yǎng)液。

1.5 不同胎齡兔PGCs分離培養(yǎng)分別取妊娠E10.5、E11.5、E12.5、E13.5、E14.5和E15.5的孕兔子宮，分離生殖嵴。以24孔板每孔接種2個生殖嵴密度為宜。24 h進(jìn)行第1次換液，之后隔天換液。

1.6 胎齡對PGCs體外培養(yǎng)的影響從不同胎齡的兔生殖嵴中分離PGCs，加入含有15% KSR的基礎(chǔ)培養(yǎng)液。每個胎齡重復(fù)接種3次，取3次的平均值記為當(dāng)天的集落數(shù)量。每天在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，記錄形成集落數(shù)量，細(xì)胞集落數(shù)量為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)，用Graphpad Prism 7制作細(xì)胞生長曲線圖。

1.9 兔PGCs的傳代培養(yǎng)原代PGCs在體外培養(yǎng)7～10 d，對其進(jìn)行傳代培養(yǎng)，玻璃細(xì)針小心挑出集落，離心重懸后接種到新制備的飼養(yǎng)層上。

1.10 分化能力檢測PGCs體外培養(yǎng)形成集落后，用玻璃細(xì)針小心地挑出集落，轉(zhuǎn)移到含有2 mL消化液的離心管中。離心后用不含LIF的基礎(chǔ)液A(加入15% KSR)，去除飼養(yǎng)層，接種在96孔板上。

1.11 兔PGCs多能性的鑒定

1.11.1形態(tài)學(xué)觀察 PGCs接種之后，每24 h在顯微鏡下觀察PGCs的狀態(tài)并拍照。

1.11.2堿性磷酸酶(AKP)染色 按照AKP染色試劑盒的說明書進(jìn)行操作，以飼養(yǎng)層細(xì)胞為陰性對照，染色后PGCs集落中的AKP呈紅黑色，為陽性;無色或淺紅色則為陰性。

1.11.3RT-PCR檢測 引物由尚亞生物技術(shù)公司合成(表2)。收取未分化的集落，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行DNA凝膠電泳。PCR 20 μL反應(yīng)體系為：PrimeScript RT Enzyme Mix 10 μL,上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，dd H2O 7 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 30 s；95℃ 5 s(40個循環(huán));60℃ 30 s。

表2 PCR擴(kuò)增引物

2 結(jié)果

2.1 兔PGCs生長行為觀察在倒置顯微鏡下，兔PGCs表現(xiàn)出相互吸附、聚集和遷移的生物學(xué)特征，呈條索狀(圖1A)。隨后PGCs繼續(xù)遷移及增殖，鋪滿24孔板底部。呈現(xiàn)1個較大集落，似ES形態(tài)，有1個大的半透明核，1個突出的單個核仁，相對較少的細(xì)胞質(zhì)，PGCs聚集成島嶼狀或巢狀，集落中細(xì)胞之間排列致密，界線不清，表面光滑，但集落邊緣清晰，立體感強(qiáng)(圖1B)。PGCs遷移過程中，也會有空泡狀的集落出來(圖1C)，同時進(jìn)行大量的增殖(圖1D)。

2.2 傳代后的PGCs傳代之后單個PGCs仍可以聚集形成集落，但是傳代后的集落形態(tài)沒有原代立體。第1次傳代后PGCs遷移聚集成集落樣生長的能力較強(qiáng)，細(xì)胞活性較好(圖2A)；第2次傳代后PGCs仍可以聚集成集落樣生長，但細(xì)胞的活力有所降低，有很多單細(xì)胞沒有聚集成明顯的集落(圖2B)。這表明隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞活力會逐漸降低。本試驗(yàn)只進(jìn)行了2次傳代。

A.第1次傳代后的PGCs；B.第2次傳代后的PGCs(40×)

2.3 兔PGCs多能性鑒定將集落進(jìn)行AKP染色，為紅黑色，呈陽性，集落內(nèi)的細(xì)胞展現(xiàn)出很高的AKP活性，飼養(yǎng)層不著色(圖3A)，這是多能性細(xì)胞的標(biāo)志。PGCs可以自發(fā)分化為成纖維樣、上皮樣、神經(jīng)樣等細(xì)胞(圖3B、C)。形成的PGCs克隆(EGCs)，消化為單細(xì)胞懸液，撤去LIF和飼養(yǎng)層后，培養(yǎng)5 d可形成擬胚體(圖3D)。擬胚體在顯微鏡下觀察呈球狀。這也表明PGCs在體外特定的培養(yǎng)條件下可以重編程為具有多能性EGCs，多能性O(shè)CT-4基因呈陽性表達(dá)(圖4)。

A.AKP染色呈陽性；B.PGCs分化為神經(jīng)樣細(xì)胞；C.PGCs分化為上皮樣細(xì)胞(40×)；D.擬胚體

M.DL2000 DNA Marker；1.GAPDH；2.陰性對照；3.OCT-4

2.4 胎齡對PGCs體外培養(yǎng)的影響E10.5和E11.5的PGCs集落數(shù)基本一致，生長曲線也基本一致。E12.5的PGCs集落數(shù)大于E13.5的PGCs集落數(shù)。E14.5和E15.5的PGCs集落數(shù)基本一致。E10.5和E11.5的PGCs集落數(shù)要明顯大于E12.5、E13.5、E14.5和E15.5。PGCs形成的集落數(shù)隨胎齡的增加依次減少(圖5)。

圖5 不同胎齡的PGCs生長曲線圖

2.5 RA、FK、4OHT對PGCs體外培養(yǎng)的影響E10.5、E13.5和E15.5的PGCs在不同培養(yǎng)液中培養(yǎng)，24 h后均沒有集落形成，72 h后均出現(xiàn)集落。H組培養(yǎng)液中的集落數(shù)量相對于其他組數(shù)量較多(表3～5)。E15.5的PGCs增殖緩慢，只有很少的集落形成。相對于E13.5和E15.5的PGCs，E10.5的PGCs在同樣培養(yǎng)液中的集落數(shù)量較多，尤其在H組培養(yǎng)液中的集落數(shù)量較多。

表3 E10.5胎兔PGCs集落個數(shù)

2.6 有無血清對兔PGCs體外培養(yǎng)的影響在15% FBS組中，以A組培養(yǎng)液集落數(shù)量為對照，其中E、F、G和H的培養(yǎng)液集落數(shù)量均顯著多于A組，H組培養(yǎng)液中的集落數(shù)量較多；在15% KSR組中，以A組培養(yǎng)液集落數(shù)量為對照，其中E、F、G和H的培養(yǎng)液集落數(shù)量均顯著多于A組，H組培養(yǎng)液中的集落數(shù)量較多。且含15% KSR培養(yǎng)液中的集落數(shù)量均多于含15% FBS培養(yǎng)液中的集落數(shù)量(圖6)。

表4 E13.5胎兔PGCs集落個數(shù)

表5 E15.5胎兔PGCs集落個數(shù)

A～F.A～F組培養(yǎng)液

3 討論

3.1 體外培養(yǎng)過程中PGCs的生物學(xué)特性本研究發(fā)現(xiàn)PGCs在體外培養(yǎng)過程成中會相互吸附、遷移、聚集成集落狀，最后形成EGCs集落。EGCs可以分化為神經(jīng)樣細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞和擬胚體。PGCs遷移過程中有空泡狀的集落出現(xiàn)，馬倩等[3]在研究豬PGCs生物學(xué)特性中發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)初期原代PGCs有大量“出芽”或“發(fā)泡”狀的細(xì)胞。有學(xué)者在研究爪蟾胚胎24期時發(fā)現(xiàn)，PGCs會呈現(xiàn)小的泡狀結(jié)構(gòu)，隨著胚胎的發(fā)育，泡狀結(jié)構(gòu)也在變大，細(xì)胞伸展變得更加細(xì)長，此時PGCs的活性很高[4]。也有研究表明，PGCs泡狀結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)可能與細(xì)胞的遷移行為有關(guān)，如變形蟲等。當(dāng)變形蟲移動時，它的前端會出現(xiàn)一個氣泡，推動作用的產(chǎn)生依賴于肌動球蛋白收縮[5]。纖維狀肌動蛋白出現(xiàn)在拉伸的爪蟾PGCs的后半段[4]。

3.2 胎齡對PGCs體外培養(yǎng)的影響PGCs特化形成后，開始向生殖嵴的方向遷移，在遷移的過程中PGCs會進(jìn)行快速、大量增殖，同時PGCs的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)特性也會發(fā)生變化，不同胎齡的PGCs的基因表達(dá)譜是不一樣的[6]。因此，選擇合適的胎齡對PGCs的體外培養(yǎng)至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示E10.5和E11.5兔胚胎PGCs體外培養(yǎng)時，重編程為EGCs集落的效率較高，與之前的研究結(jié)果一致[7]。胚胎的早期階段PGCs重編程為EGCs展示出較高的效率，但是PGCs的這種能力隨著胎齡的增長會逐漸降低，在E15.5之后，PGCs不能重編程為EGCs[8]。

3.3 RA、FK和4OHT對PGCs體外培養(yǎng)的影響RA作為生殖功能必要調(diào)節(jié)因子，顯著增加PGCs在體外遷移階段的細(xì)胞數(shù)量，延緩PGCs在體外衰老[9-10]。RA生物學(xué)功能是通過RA受體RARs所介導(dǎo)，主要有RAR的異二聚體和維甲酸X受體(retinoid X receptor，RXR)。FK和RA作為PGCs的“促分裂劑”，可刺激PGCs的體外增殖和延緩衰退。FK可激活蛋白激酶A下游通路從而明顯促進(jìn)雞PGCs增殖[11]。RA和FK聯(lián)合使用會增加PGCs集落的形成并有利于長期體外培養(yǎng)[12]。另外在培養(yǎng)液中添加4OHT，可激活PGCs內(nèi)的AKT反應(yīng)，激活A(yù)KT-MER蛋白，從而上調(diào)或下調(diào)一些關(guān)鍵基因的表達(dá)，促進(jìn)PGCs重編程為EGCs，如AKT的激活會使BAX基因表達(dá)下調(diào)，BAX是BCL2基因家族的一個成員，它的生理功能是促進(jìn)多種細(xì)胞凋亡，包括PGCs。AKT的激活可以替代bFGF在PGCs重編程為EGCs中的作用。本試驗(yàn)在培養(yǎng)液中加入RA、FK和4OHT 3種小分子復(fù)合物比不加入或只加入其中2種的PGCs集落數(shù)量要多。

總之，小分子復(fù)合物會啟動細(xì)胞內(nèi)信號通路，參與表觀遺傳修飾和代謝過程，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、命運(yùn)和功能。小分子復(fù)合物被廣泛的用于重編程和轉(zhuǎn)分化領(lǐng)域，可以促進(jìn)靶細(xì)胞向目標(biāo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化[13]。小分子復(fù)合物具有細(xì)胞滲透性和非免疫原性[14-16]，此外，它們價格低廉、易于合成和保存。

3.4 FBS和KSR對PGCs體外培養(yǎng)的影響血清中含有已知的和未知的動物源性病原體[17]，這可能會導(dǎo)致人類胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells,hESCs)的異物污染，從而阻礙干細(xì)胞的臨床應(yīng)用[18]。因此許多研究者嘗試建立新的培養(yǎng)系統(tǒng)或優(yōu)化現(xiàn)有培養(yǎng)系統(tǒng)以減少干細(xì)胞的污染[17]。本研究結(jié)果證明，無血清培養(yǎng)體系更有利于PGCs集落的形成，更有利于體外重編程為EGCs。