張玉琴，陸云飛，張海添

0 引言

激素受體陽(yáng)性的乳腺癌約占全部乳腺癌的75%，內(nèi)分泌治療的出現(xiàn)極大改善了這部分乳腺癌患者的預(yù)后，但是現(xiàn)有的內(nèi)分泌治療藥物僅針對(duì)ER（+）、PR（+）的患者，部分ER（-）、PR（-）患者不能從中獲益。大量實(shí)驗(yàn)證明，雄激素受體（androgen receptor,AR）在乳腺癌組織中存在高表達(dá)[1]，LAR型乳腺癌被認(rèn)為有較好的預(yù)后、較低的化療反應(yīng)率及pCR率[2]，我們前期實(shí)驗(yàn)也證明，AR的表達(dá)與ER、PR的表達(dá)相關(guān)，且與乳腺癌的組織學(xué)分級(jí)和患者月經(jīng)狀態(tài)有關(guān)[3]。因此我們認(rèn)為以AR為靶點(diǎn)的內(nèi)分泌治療有可能改善部分乳腺癌患者的生存。有研究表明AR的表達(dá)與PI3K/AKT/mTOR通路的突變存在一定聯(lián)系，PI3K在AR陽(yáng)性乳腺癌中的突變率是陰性者的10倍[4]，AR過(guò)表達(dá)的MDAMB-453乳腺癌細(xì)胞株中，在給予AR受體抑制劑比卡魯胺后，AKT的表達(dá)受到明顯抑制[3]。依維莫司是哺乳動(dòng)物雷帕霉素（mammalian target of rapamycin,mTOR）抑制劑，可抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及血管形成[5]。本研究旨在進(jìn)一步探索AR在乳腺癌中的作用機(jī)制及以依維莫司為代表的PI3K通路抑制劑與比卡魯胺聯(lián)用對(duì)乳腺癌細(xì)胞株增殖作用的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MCF-7由廣西醫(yī)科大學(xué)病理科提供，MDA-MB-453購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，MDA-MB-231、MDAMB-453細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，MCF-7細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試劑

比卡魯胺（CDX）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，依維莫司購(gòu)自美國(guó)Selleck公司，兔抗人mTOR、p-mTOR、p-S6購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Costar公司，Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 Western blot檢測(cè)用藥前后mTOR、p-mTOR及p-S6的表達(dá)水平

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整MDA-MB-231及MCF-7細(xì)胞濃度為每毫升0.5×103個(gè)，MDAMB-453細(xì)胞濃度為每毫升4×103個(gè)，分成實(shí)驗(yàn)組：每孔加入30 μmol/L比卡魯胺稀釋液200 μl，空白組：只加200 μl培養(yǎng)基，作用細(xì)胞6天后，收集提取各組蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，按照標(biāo)準(zhǔn)Western blot步驟，依次進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，5%牛奶封閉，一抗（mTOR 1:1000,p-mTOR 1:1000，p-S6：1:1000）4℃過(guò)夜，TBS-T洗膜3次，二抗（1:10000）室溫孵育90 min，TBS-T洗膜，曝光，GAPDH作內(nèi)參，運(yùn)用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.4 Transwell檢測(cè)聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞遷移侵襲影響

將各組細(xì)胞置于無(wú)血清培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)24 h后，以每毫升2×106個(gè)濃度接種于8 mm孔徑的Transwell小室上室（上室鋪經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋后的Matrigel膠，Matrigel:無(wú)血清培養(yǎng)基=1:9），小室內(nèi)細(xì)胞置于200 μl無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基中，下室為200 μl含20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板在37℃、5%CO2、濕度適宜的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，對(duì)下室細(xì)胞進(jìn)行結(jié)晶紫染色，并拍照計(jì)數(shù)。

1.5 MTT方法檢測(cè)藥物抑制率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整MDA-MB-453細(xì)胞終濃度為每毫升6×103個(gè)，按每孔100 μl接種于96孔板中，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后吸盡孔內(nèi)培養(yǎng)基，分三組：依維莫司單藥組：每孔分別加入200 μl不同濃度依維莫司（30、25、20、10、5 μmol/L）；比卡魯胺單藥組：每孔加入200 μl 30 μmol/L的比卡魯胺；聯(lián)合用藥組：依維莫司（30、25、20、10、5 μmol/L）+比卡魯胺30 μmol/L；空白組：只加入200 μl培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)副孔。藥物作用72 h后，每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT溶液。置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h。最后用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔在490 nm處的吸光度值，并記錄結(jié)果，分別算出單藥及聯(lián)用時(shí)的IC50，繪制藥物抑制率曲線。

1.6 金正均法計(jì)算兩藥聯(lián)用指數(shù)

采用金正均Q值計(jì)算法[6]評(píng)估兩藥聯(lián)用效果，公式：Q=Ea+b／(Ea+Eb-Ea×Eb)，公式中Ea+b為聯(lián)合用藥處理組的抑制率，Ea、Eb分別為a藥和b藥單獨(dú)處理時(shí)的抑制率。若Q值為0.85～1.15表示兩藥合用單純相加，若Q＞1.15表示兩藥聯(lián)用有協(xié)同作用，若Q＜0.85 表示兩藥合用有拮抗作用。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較用方差分析，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較采用SNK法；兩個(gè)獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 比卡魯胺對(duì)乳腺癌細(xì)胞株及mTOR磷酸化的影響

根據(jù)前期MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，30 μmol/L的比卡魯胺處理乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MCF-7、MDA-MB-453，6天后實(shí)驗(yàn)組中mTOR的表達(dá)較對(duì)照組均有下降（實(shí)驗(yàn)組：0.90±0.08、0.81±0.03、0.74±0.04，空白組：0.94±0.02、0.9±0.13、1.05±0.07），其中在MDA-MB-231及MCF-7細(xì)胞中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.79、0.95,P=0.51、0.51），在MDA-MB-453細(xì)胞中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.04,P=0.04），實(shí)驗(yàn)組與空白組中p-mTOR表達(dá)量不同（實(shí)驗(yàn)組：0.65±0.05、1.12±0.06、1.28±0.10，空白組：0.74±0.09、1.28±0.17、1.68±0.06），其中在MDA-MB-453中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.038,P=0.049），在其余兩株細(xì)胞中無(wú)明顯差異（t=0.79、0.95,P=0.51、0.50）。三株細(xì)胞系中p-S6的表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組與空白組比較差有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（實(shí)驗(yàn)組：0.68±0.03、0.57±0.03、0.26±0.07，空白組：0.60±0.04、0.70±0.05、0.57±0.04），其中在MDA-MB-453中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.57,P=0.03），而在其余兩株細(xì)胞中均未見(jiàn)明顯差異（t=2.35、3.28,P=0.143、0.082）。Western blot結(jié)果顯示，MDA-MB-453細(xì)胞中mTOR、p-mTOR、p-S6的表達(dá)均較空白組明顯降低，而MDA-MB-231和MCF-7實(shí)驗(yàn)組中mTOR、p-mTOR、p-S6的表達(dá)較空白組均未見(jiàn)明顯下降，見(jiàn)圖1。

2.2 比卡魯胺對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移侵襲的影響

比卡魯胺作用乳腺癌細(xì)胞株6天后，細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組MDA-MB-453細(xì)胞中穿膜細(xì)胞數(shù)（11.33±3.72）個(gè)，空白組（27.75±5.31）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-4.88,P=0.001）；實(shí)驗(yàn)組MCF-7穿膜細(xì)胞數(shù)（35.00±3.37）個(gè)，空白組（23.25±5.25）個(gè)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.31,P=0.06）；實(shí)驗(yàn)組MDA-MB-231細(xì)胞中穿膜細(xì)胞數(shù)（28.62±6.24）個(gè)，空白組（25.00±5.05）個(gè)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.87,P=0.42）。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組MDA-MB-453細(xì)胞中穿膜細(xì)胞數(shù)（16.83±7.11）個(gè)，空白組（27.75±4.65）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-2.68,P=0.03）；實(shí)驗(yàn)組MCF-7細(xì)胞中穿膜細(xì)胞數(shù)（32.60±5.90）個(gè)，空白組（34.40±8.26）個(gè)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-0.37,P=0.72）；實(shí)驗(yàn)組MDA-MB-231細(xì)胞中穿膜細(xì)胞數(shù)（32.00±4.24）個(gè)，空白組（30.67±9.07）個(gè)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.86,P=0.86），見(jiàn)圖2。

2.3 比卡魯胺聯(lián)合依維莫司對(duì)乳腺癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，依維莫司單藥作用MDAMB-453細(xì)胞時(shí)IC50為（16.84±0.06）μmol/L，聯(lián)用比卡魯胺后，藥物的IC50為（9.35±0.09）μmol/L。細(xì)胞抑制率曲線顯示，聯(lián)合用藥后各組不同濃度下的抑制率均較單藥組明顯升高，比卡魯胺單藥組細(xì)胞的抑制率為（5.36±0.04）%。金正均法計(jì)算Q值發(fā)現(xiàn)依維莫司聯(lián)用比卡魯胺組的抑制率明顯升高，且在各個(gè)濃度下Q值均＞1.15，表明比卡魯胺與依維莫司聯(lián)合用藥具有協(xié)同作用，見(jiàn)表1。

3 討論

圖1 比卡魯胺作用前后MDA-MB-231、MCF-7和MDA-MB-453細(xì)胞中mTOR、p-mTOR和p-S6表達(dá)Figure 1 Expression of mTOR,p-mTOR and p-S6 in breast cancer cell lines MDA-MB-231,MCF-7 and MDA-MB-453 before and after bicalutamide treatment

圖2 三株乳腺癌細(xì)胞株遷移(A)和侵襲(B)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure 2 Migration(A) and invasion(B) tests of three breast cancer cell lines

LAR亞型的三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）存在PI3KCA及PTEN突變，對(duì)mTOR抑制劑較敏感[7]，mTOR被細(xì)胞外生長(zhǎng)信號(hào)激活后，通過(guò)磷酸化激活下游激酶，形成兩個(gè)獨(dú)立的復(fù)合物mTORC1和mTORC2，核糖體蛋白激酶（S6K）是mTOR下游調(diào)節(jié)因子，mTORC1-S6K復(fù)合物的形成可以控制DNA的損傷應(yīng)答反應(yīng)[8]。其表達(dá)量越高，對(duì)mTOR抑制劑的敏感度越強(qiáng)，提示S6K可作為預(yù)測(cè)mTOR抑制劑敏感度的指標(biāo)[9]。

本課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MDA-MB-453為AR強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞株，MCA-7和MDA-MB-231為AR弱陽(yáng)性細(xì)胞株，比卡魯胺的抑制作用呈現(xiàn)時(shí)間及劑量依賴性，延長(zhǎng)比卡魯胺用藥時(shí)間及增加藥物濃度，可提高對(duì)MDA-MB-453細(xì)胞增殖抑制作用，而對(duì)MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞的增殖均未見(jiàn)明顯影響[3]。PIK3CA所編碼的蛋白是PI3K的一部分，能參與PI3K的活化，有研究證實(shí)，在AR陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞中，PIK3CA的突變率為40%，遠(yuǎn)高于AR陰性的4%[10]。比卡魯胺作用6天后，MDA-MB-453細(xì)胞遷移侵襲能力降低，mTOR、p-mTOR、p-S6的含量明顯降低，表明比卡魯胺能抑制mTOR/S6的磷酸化活性，從而抑制細(xì)胞增殖及遷移侵襲能力，但是對(duì)MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞株并未產(chǎn)生明顯影響。

目前PI3K/AKT/mTOR通路抑制劑種類繁多，較明確的是mTOR抑制劑依維莫司，依維莫司作用于mTOR位點(diǎn)，是mTORC1的選擇性抑制劑，與細(xì)胞內(nèi)蛋白FKBP12結(jié)合形成的復(fù)合體mTORC1抑制mTOR的活性。mTOR的抑制可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子S6和真核生物延伸因子4E-結(jié)合蛋白（4E-BP）活性的降低，從而干擾細(xì)胞周期、血管新生、糖酵解等相關(guān)蛋白的翻譯和合成[11]。MCF-7中AKT的高表達(dá)，可使細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)分泌治療的抵抗，抑制AKT及mTOR可恢復(fù)其對(duì)他莫昔芬或來(lái)曲唑的敏感度并且促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12-13]。一項(xiàng)Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)表明，在ER陽(yáng)性患者中，依維莫司能增加腫瘤細(xì)胞對(duì)來(lái)曲唑的敏感度[14]。在前列腺癌細(xì)胞中，同時(shí)抑制AR及PI3K較單用AR抑制劑或PI3K抑制劑能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]，在三陰性乳腺癌中，p-mTOR的表達(dá)與AR的表達(dá)相關(guān)，提示我們對(duì)于AR受體陽(yáng)性的乳腺癌，抑制AR及mTOR受體可抑制腫瘤細(xì)胞增殖[16-17]，因此猜想，依維莫司聯(lián)合AR抑制劑可能增強(qiáng)對(duì)AR強(qiáng)陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的抑制效果。

表1 不同濃度依維莫司與比卡魯胺聯(lián)合作用于MDA-MB-453細(xì)胞的抑制率 (%)Table 1 Inhibition rates of different concentration of everolimus combined with bicalutamide on MDA-MB-453 cells (%)

為了進(jìn)一步研究mTOR抑制劑依維莫司與比卡魯胺聯(lián)用對(duì)乳腺癌細(xì)胞株的效應(yīng)作用，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)，本研究選擇30 μmol/L的比卡魯胺與不同濃度的依維莫司聯(lián)用。聯(lián)合用藥后，在各個(gè)濃度下，藥物的抑制率均較用藥前增加，通過(guò)計(jì)算Q值發(fā)現(xiàn)，兩藥聯(lián)用有協(xié)同作用。因此我們認(rèn)為依維莫司能增加MDA-MB-453對(duì)比卡魯胺的敏感度。

綜上所述，比卡魯胺對(duì)AR強(qiáng)陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453的增殖抑制作用是通過(guò)抑制mTOR及其下游轉(zhuǎn)錄因子S6K的磷酸化實(shí)現(xiàn)的，并可抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力。AR可以作為乳腺癌的治療靶點(diǎn)，本研究認(rèn)為比卡魯胺與依維莫司聯(lián)用可增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)抗雄激素治療的敏感度，其抑制效果與AR的磷酸化程度及AR的表達(dá)量有關(guān)，AR的含量有可能成為預(yù)測(cè)抗AR治療敏感度的標(biāo)志，其臨界值值得進(jìn)一步研究。