鐘 靜， 張瑤心， 李景蕻， 陳功軒

(湖北第二師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，植物抗癌活性物質(zhì)提純與應(yīng)用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430205)

土壤為植物生長提供必需的生活條件，是動物生存的自然環(huán)境[1]。但是隨著工業(yè)化進(jìn)程的迅猛發(fā)展，我國土壤重金屬污染問題日益嚴(yán)重，其中鉛是最常見的一種重金屬污染物[2]。土壤中的鉛主要來源于鋅礦開采中廢液廢氣的排放、農(nóng)藥和化肥的濫用、含鉛汽油的使用等[3]。鉛不易代謝和降解，土壤中的鉛可被植物根系吸收并在體內(nèi)積累，擾亂植物正常的生理過程，最終對植物產(chǎn)生嚴(yán)重的毒害作用[4]。此外，通過食物鏈，鉛進(jìn)入人體后對機(jī)體的神經(jīng)、心血管、泌尿和內(nèi)分泌等多個(gè)生理系統(tǒng)造成危害，甚至導(dǎo)致鉛中毒[5]。

薏苡(Coixlachrymal-jobiL.)是禾本科薏苡屬的草本植物，是我國一種傳統(tǒng)的藥食兩種作物[6]。薏苡種仁在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中是一種常用的利水滲濕藥材[7]。近年研究發(fā)現(xiàn)，從薏苡仁中提取的薏苡仁油不僅可以殺死癌細(xì)胞，還能顯著提高機(jī)體的免疫功能[8]。目前，關(guān)于鉛脅迫對植物生長發(fā)育影響的研究較多，但是薏苡屬植物對鉛脅迫生理響應(yīng)的研究還未見報(bào)道。本試驗(yàn)以薏苡仁為研究材料，檢測了不同鉛脅迫程度對薏苡種子萌發(fā)和幼苗生長的影響；通過比較不同濃度硫酸鉛條件下薏苡幼苗葉片丙二醛(MDA)和脯氨酸含量、SOD活性、相對電導(dǎo)率、葉綠素和類胡蘿卜素含量來深入分析鉛脅迫對薏苡幼苗生理活動的作用，以期為薏苡種植過程中預(yù)防鉛傷害提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試材料購自湖北省黃岡市蘄春縣種植的薏苡種子。去除干癟種子后，選取大小均勻的種子備用。

1.2 硝酸鉛處理實(shí)驗(yàn)

消毒薏苡種子浸泡于75%乙醇中15 min，無菌水沖洗5次。滅菌濾紙吸干種子表面水分后均勻放于發(fā)芽床。發(fā)芽床為內(nèi)墊雙層滅菌濾紙的培養(yǎng)皿(直徑12 cm)。將不同濃度的硝酸鉛溶液倒入皿中至濾紙飽和。發(fā)芽床置于25 ℃、2 000 lx光照強(qiáng)度、12 h/12 d光照周期下進(jìn)行萌發(fā)和生長培養(yǎng)。每天更換溶液，設(shè)置硝酸鉛濃度為：0(ck)、15、30、45、60 mg·L-1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)處理濃度至少100粒薏苡種子。

1.3 測定指標(biāo)

1.3.1萌發(fā)指標(biāo)

種子發(fā)芽以胚根生長至種子長度的一半為準(zhǔn)。從培養(yǎng)第2天開始逐日統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽數(shù)。參考王璽等[9]的方法，按照下列公式計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)：

發(fā)芽率(%)=(10 d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/實(shí)驗(yàn)種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽勢(%)=(4 d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/實(shí)驗(yàn)種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽指數(shù)=∑第10天發(fā)芽數(shù)/10 d；

活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)×苗高。

1.3.2幼苗生長指標(biāo)

培養(yǎng)10 d后，從不同處理濃度的萌發(fā)幼苗中各隨機(jī)選取15株，測定幼苗主根根長和苗高。

1.3.3生理生化指標(biāo)的測定

取培養(yǎng)第10天的幼苗葉片進(jìn)行生理生化指標(biāo)的測定。參考王學(xué)奎[10]的方法測定相對電導(dǎo)率，葉綠素和類胡蘿卜素含量(采用乙醇提取法測定)；MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法[11]測定；參考彭昌琴等[12]的方法測定脯氨酸含量；參考吳曉敏等[13]的方法測定SOD活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0軟件和Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉛脅迫對薏苡種子萌發(fā)的影響

比較不同濃度硝酸鉛對薏苡種子萌發(fā)的影響，未添加硝酸鉛的對照組種子發(fā)芽率達(dá)80%，中高濃度的硝酸鉛抑制種子的發(fā)芽。60 mg·L-1硝酸鉛處理后，種子發(fā)芽率降至55.56%，發(fā)芽率降低了近1/3(表1)。對照組種子發(fā)芽勢為66.55%，30 mg·L-1硝酸鉛處理后發(fā)芽勢開始出現(xiàn)明顯下降。當(dāng)硝酸鉛濃度升至60 mg·L-1后，發(fā)芽勢為44.44%，與對照組相比降低了22.11%(表1)。硝酸鉛對發(fā)芽指數(shù)的影響與前兩者相似，15 mg·L-1低濃度硝酸鉛對其并無明顯影響，隨著硝酸鉛濃度的升高發(fā)芽指數(shù)逐漸降低(表1)。但即使是低濃度硝酸鉛處理，活力指數(shù)仍出現(xiàn)明顯下降，從對照組的47.14%降至32.94%。當(dāng)硝酸鉛濃度升至60 mg·L-1后，活力指數(shù)比對照組降低了36.22%(表1)。

表1 鉛脅迫對薏苡種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of lead stress on seed germination of C. lacryma

2.2 鉛脅迫對薏苡幼苗生長的影響

硝酸鉛不僅抑制種子萌發(fā)，還嚴(yán)重影響萌發(fā)幼苗的生長。由表2可知，在持續(xù)的鉛脅迫中，薏苡幼苗的主根和苗高都明顯短于對照組。未添加硝酸鉛的幼苗苗高和主根分別可達(dá)8.30 cm和8.61 cm。添加15mg·L-1硝酸鉛后，苗高和主根長迅速降至5.93 cm和4.20 cm。隨著硝酸鉛濃度的升高，對幼苗生長抑制作用越顯著。當(dāng)硝酸鉛達(dá)到60 mg·L-1時(shí)，主根長僅0.52 cm，與對照組相比其生長幾乎完全被抑制；此時(shí)苗高也受到明顯抑制，但是仍有2.8 cm。可見鉛脅迫對幼苗主根的影響高于對苗的影響。

表2 鉛脅迫對薏苡幼苗生長的影響Table 2 Effects of lead stress on seedling growth of C. lacryma

2.3 鉛脅迫對薏苡幼苗葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量的影響

對不同濃度硝酸鉛處理后薏苡萌發(fā)幼苗葉片葉綠素和類胡蘿卜素進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，硝酸鉛處理后葉綠素含量降低。15 mg·L-1硝酸鉛處理對葉片中葉綠素a含量的影響較小，從對照組的1.64 mg·g-1降至1.56 mg·g-1，降幅為4.88%；此時(shí)，葉綠素b含量從0.55 mg·g-1降至0.49 mg·g-1，降幅(10.91%)高于葉綠素a(圖1)。30 mg·L-1硝酸鉛處理后，葉綠素a和葉綠素b含量分別為1.44 mg·g-1和0.43 mg·g-1。60 mg·L-1硝酸鉛處理后，葉綠素a和葉綠素b含量分別為1.11 mg·g-1和0.30 mg·g-1，降幅分別為32.32%和45.45%(圖1)。硝酸鉛處理也導(dǎo)致葉片中類胡蘿卜素含量的降低。15 mg·L-1硝酸鉛處理后，類胡蘿卜素含量即從對照組的1.23 mg·g-1降至1.05 mg·g-1，降幅達(dá)14.63%，明顯高于葉綠素a的降幅。45 mg·L-1硝酸鉛處理后，類胡蘿卜素含量降低至0.66 mg·g-1，降幅為對照組的46.34%。60 mg·L-1的硝酸鉛處理后，類胡蘿卜素含量大幅下降到0.37 mg·g-1，降幅高達(dá)69.92%(圖1)。

2.4 鉛脅迫對薏苡幼苗葉片MDA含量的影響

測定了不同濃度硝酸鉛處理后葉片中MDA含量。結(jié)果顯示，MDA含量隨著硝酸鉛濃度的升高而逐漸增加(圖2)。對照組中MDA含量較低，僅28.46 μmol·g-1。添加低濃度(15 mg·L-1)硝酸鉛后，MDA含量微弱上升至30.35 μmol·g-1。30 mg·L-1硝酸鉛處理后，MDA含量升高至32.86 μmol·g-1，與對照組相比增加了15.46%。45 mg·L-1硝酸鉛處理后，MDA增至39.1 μmol·g-1，比對照增加了37.39%。60 mg·L-1硝酸鉛處理后，MDA含量為43.28 μmol·g-1，比對照增加了52.07%(圖2)。

2.5 鉛脅迫對薏苡幼苗葉片相對電導(dǎo)率的影響

同時(shí)還對硝酸鉛處理后葉片的相對電導(dǎo)率進(jìn)行了測定。由圖3可知，鉛脅迫引起相對電導(dǎo)率的逐漸升高。但是中低濃度硝酸鉛(15 mg·L-1和30 mg·L-1)對相對電導(dǎo)率的作用較小。當(dāng)硝酸鉛濃度升至45 mg·L-1后，相對電導(dǎo)率開始出現(xiàn)明顯上升，從對照組的35.65%升至45.27%。當(dāng)硝酸鉛濃度升至60 mg·L-1后，相對電導(dǎo)率升至49.13%，與對照組相比升高幅度為37.81%。

2.6 鉛脅迫對薏苡幼苗葉片SOD活性的影響

對不同濃度硝酸鉛處理后薏苡萌發(fā)幼苗葉片中SOD的測定，由圖4可知，中低濃度硝酸鉛處理對葉片中SOD活性有輕微促進(jìn)作用。當(dāng)硝酸鉛濃度升至45 mg·L-1后，SOD活性開始下降，從對照組的398.33 U·g-1降至365.87 U·g-1，降幅為8.15%。當(dāng)硝酸鉛濃度升至60 mg·L-1后，SOD活性降至321.65 U·g-1，分別比對照組和45 mg·L-1硝酸鉛處理組降低19.25%和12.09%，降幅較為明顯。

2.7 鉛脅迫對薏苡幼苗葉片脯氨酸含量的影響

對不同濃度硝酸鉛處理?xiàng)l件下，薏苡萌發(fā)幼苗葉片中脯氨酸含量測定結(jié)果顯示，15 mg·L-1硝酸鉛處理對葉片中脯氨酸含量的影響并不十分顯著，從對照組的40.06 μg·g-1升至44.01 μg·g-1，僅增加7.18%。當(dāng)硝酸鉛濃度升至30 mg·L-1后，脯氨酸增幅開始出現(xiàn)明顯變化，且硝酸鉛濃度越高脯氨酸含量增加越明顯(圖5)。45 mg·L-1硝酸鉛處理后，脯氨酸含量升至58.62 μg·g-1，升高比例為42.77%。60 mg·L-1硝酸鉛處理，脯氨酸含量攀升至74.42 μg·g-1，升高比例高達(dá)81.25%(圖5)。

3 討 論

鉛并不是植物必需的微量元素，相反它對動植物都具有很大的毒性[14]。植物對鉛脅迫的響應(yīng)是通過多種途徑的。本實(shí)驗(yàn)主要通過比較不同濃度硝酸鉛處理?xiàng)l件下，薏苡種子萌發(fā)和幼苗生長的差異來探討鉛脅迫對薏苡生理活動的影響。

研究表明，低濃度(15 mg·L-1)硝酸鉛對薏苡種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)并無明顯抑制效果，對活力指數(shù)的抑制影響十分顯著。但是薏苡種子的這4個(gè)萌發(fā)指標(biāo)受中高濃度(30～60 mg·L-1)硝酸鉛的影響呈現(xiàn)明顯的抑制效應(yīng)(表1)。這說明薏苡種子對鉛脅迫具有一定的抗性。鉛脅迫程度的加深可能破壞了種子萌發(fā)所必須的生理?xiàng)l件，因此表現(xiàn)出對種子萌發(fā)的抑制。此外，即使是低濃度硝酸鉛處理，幼苗主根和苗高顯著短于未進(jìn)行鉛脅迫的對照組。說明薏苡幼苗生長對于鉛脅迫十分敏感。同時(shí)還觀察到，鉛脅迫對幼苗主根的抑制效果要明顯高于苗高，這可能是由于種子內(nèi)含的營養(yǎng)物質(zhì)足夠支撐自身萌發(fā)，所以低濃度鉛脅迫對其影響很小，但是萌發(fā)之后，幼苗生長所需要的物質(zhì)很多都需要通過根從外部環(huán)境中吸收。鉛在幼苗體內(nèi)首先會在根中積累，隨后才被運(yùn)輸至葉片中，因此首先受到毒害的部位是根，隨后才是地上部分。隨后對葉綠素和類胡蘿卜素含量進(jìn)行了測定。盡管低濃度硝酸鉛處理能夠在一定程度上降低葉綠素a的含量，但是變化并不顯著。低濃度硝酸鉛處理后，葉綠素b和類胡蘿卜素降幅分別為10.91%和14.63%，明顯高于葉綠素a。高濃度(60 mg·L-1)硝酸鉛處理后，葉綠素a和葉綠素b降幅分別為32.32%、45.45%，而類胡蘿卜素降幅則高達(dá)69.92%(圖1)。這表明在薏苡幼苗葉片中，類胡蘿卜素的生成對鉛脅迫的敏感性高于葉綠素。植物利用葉綠素進(jìn)行光合作用，本研究結(jié)果說明硝酸鉛可能通過降低植物對光的吸收和轉(zhuǎn)化，從而影響薏苡幼苗的生長。

膜脂過氧化的主要產(chǎn)物是MDA，因此機(jī)體內(nèi)MDA的積累在一定程度上反映了植物受傷害程度[15]。在本實(shí)驗(yàn)中，低濃度硝酸鉛處理后，薏苡幼苗葉片中MDA含量并無明顯變化(圖2)。這有可能是因?yàn)榇藭r(shí)葉片中積累的鉛含量還比較低，對細(xì)胞膜完整性的影響較小。但是，中高濃度硝酸鉛處理后，葉片中MDA含量隨硝酸鉛濃度的增加而逐漸上升。尤其在60 mg·L-1硝酸鉛處理后，葉片中MDA含量增至對照組的1.5倍(圖2)。這可能是隨著硝酸鉛濃度的增加，鉛被不斷運(yùn)輸至葉片并積累，對質(zhì)膜的損害作用逐漸呈現(xiàn)。質(zhì)膜完整性被破壞，細(xì)胞膜選擇透性喪失，會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)的外滲，引起相對電導(dǎo)率的上升[16]。本研究檢測了硝酸鉛處理后薏苡幼苗葉片相對電導(dǎo)率的變化，發(fā)現(xiàn)其隨著鉛脅迫程度的加深而升高。其中，中低濃度(15 mg·L-1和30 mg·L-1)硝酸鉛處理后相對電導(dǎo)率的上升十分微弱；當(dāng)硝酸鉛濃度升至45 mg·L-1后，相對電導(dǎo)率開始出現(xiàn)顯著變化(圖3)。

SOD是機(jī)體內(nèi)負(fù)責(zé)清除氧自由基的一種保護(hù)酶[17]。與對照組相比，中低濃度的硝酸鉛可以微弱的促進(jìn)葉片中SOD活性。但是當(dāng)硝酸鉛濃度持續(xù)升高后，葉片中SOD含量開始顯著降低(圖4)。此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低濃度的硝酸鉛處理對脯氨酸含量的影響并不顯著；但是當(dāng)硝酸鉛濃度提高到30 mg·L-1后，脯氨酸含量隨處理濃度的升高而顯著升高(圖5)。脯氨酸是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，薏苡幼苗可能通過多種途徑來抵抗鉛脅迫，如通過提高SOD酶活性來抵抗逆境下產(chǎn)生的過量氧自由基，從而實(shí)現(xiàn)保護(hù)自身的作用。但是隨著鉛脅迫程度的不斷升高，毒害作用逐漸加深、機(jī)體的許多生理過程遭到破壞，其中必然包括保護(hù)酶類合成過程，因此SOD酶活性不斷下降；同時(shí)葉片通過提高脯氨酸含量，為細(xì)胞提供足夠的自由水、防止蛋白質(zhì)脫水變性，以維持正常的生命活動。