劉 偉， 李智文， 趙 柳， 沈瑩華， 段 鵬

(1.陜西省農(nóng)業(yè)檢驗(yàn)檢測(cè)中心，陜西 西安 710003；2.陜西先農(nóng)生物科技有限公司，陜西 西安 710018)

血根堿硫酸鹽又名硫酸血根堿、血根堿等，化學(xué)名稱為：1，3-二氧雜環(huán)戊烯并[4'，5'：4，5]苯并[1，2-c] [1，3]間二氧雜環(huán)戊烯并[4，5-i]菲啶-13-硫酸鹽[1]，化學(xué)結(jié)構(gòu)式：C40H28N2O12S，(圖1)所示，是從罌粟科(Papaveraceae)博落回屬(Macleaya)多年生草本植物博落回中提取的異喹啉類生物堿，具殺蟲(chóng)、殺菌活性的一種植物源農(nóng)藥[2]。由于其不易氣化，在水溶液中又極易離解成有機(jī)陽(yáng)離子，加之提取過(guò)程含有大量其他雜質(zhì)，故不易分析。本文參考相關(guān)文獻(xiàn)[3-6]，對(duì)血根堿硫酸鹽的檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相及配比等高效液相色譜分析條件進(jìn)行了選擇與優(yōu)化，并對(duì)該方法的最小檢測(cè)量、精密度和準(zhǔn)確度作了研究。

圖1 血根堿硫酸鹽的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 試驗(yàn)部分

1.1 試劑和溶液 乙腈：色譜純；三氟乙酸：分析純；水為新蒸二次蒸餾水；氯化血根堿標(biāo)樣：已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%；40%血根堿母藥試樣。

1.2 儀器 高效液相色譜儀：Agilent1100，具可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)樣器、色譜工作站；C9860A超聲波清洗器；色譜柱：Nova-Pak C18(250mm×4.6mm，5μm)不銹鋼柱；過(guò)濾器：濾膜孔徑0.45μm。

1.3 液相色譜分析條件 以乙腈+為流動(dòng)相，采用梯度洗脫，流動(dòng)相比例和流速設(shè)定(表1)；柱溫：室溫(溫度變化<2℃)；檢測(cè)波長(zhǎng)：276nm；進(jìn)樣體積：5μL，血根堿保留時(shí)間約7.1min。典型的血根堿標(biāo)樣及其母藥的高效液相色譜圖(圖2、圖3)

表1 梯度洗脫流動(dòng)相配比和流速設(shè)定

圖2 氯化血根堿標(biāo)樣高效液相色譜圖

圖3 硫酸血根堿母藥高效液相色譜圖

1.4 測(cè)定步驟

1.4.1 標(biāo)樣溶液的配制 稱取氯化血根堿標(biāo)樣約0.007g(精確至0.000 2g)，置于10mL容量瓶中，用50%乙腈水溶液溶解并定容，作為標(biāo)樣儲(chǔ)備液。

用50%乙腈水溶液溶解對(duì)上述標(biāo)樣儲(chǔ)備液進(jìn)行梯度稀釋，配制系列濃度(濃度范圍覆蓋樣品中有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的80%～120%)標(biāo)樣溶液，作為有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)和線性范圍測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4.2 試樣溶液的配制 準(zhǔn)確稱取40%血根堿母藥樣品約0.05g(精確至0.000 2g)于25mL容量瓶中，用50%乙腈水溶液溶解并定容。取上述溶液2mL于10mL容量瓶中，用乙腈定容并搖勻，作為樣品溶液。7次平行配制樣品溶液，作為方法精密度和有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定溶液。

分別準(zhǔn)確稱取3份已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的40%血根堿母藥約0.025、0.035和0.045g(精確至0.000 2g)于25mL容量瓶中，用50%乙腈水溶液溶解并定容。取上述溶液2mL，分別添加標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(65.78mg/L)2.0mL于10mL容量瓶中，乙腈溶解并定容，作為回收率測(cè)定溶液。

1.4.3 測(cè)定 在上述操作條件下，待儀器穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，直至相鄰2針血根堿峰面積相對(duì)變化<1.5%后，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)樣分析。

1.4.4 計(jì)算 試樣中血根堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)X1(%)按式(1)計(jì)算、硫酸血根堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)X2(%)按式(2)計(jì)算：

(1)

(2)

式中：

A1—標(biāo)樣溶液中，血根堿峰面積的平均值；

A2—試樣溶液中，血根堿峰面積的平均值；

m1—標(biāo)樣的質(zhì)量，g；

m2—試樣的質(zhì)量，g；

P—標(biāo)樣中血根堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

332.3—血根堿離子的分子質(zhì)量(按2012年國(guó)際相對(duì)原子質(zhì)量計(jì))；

367.8—氯化血根堿的分子質(zhì)量(按2012年國(guó)際相對(duì)原子質(zhì)量計(jì))；

760.4—硫酸血根堿的分子質(zhì)量(按2012年國(guó)際相對(duì)原子質(zhì)量計(jì))。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 在190～400nm紫外吸收波長(zhǎng)下，對(duì)血根堿進(jìn)行掃描(圖4)，發(fā)現(xiàn)其最大吸收波長(zhǎng)為285nm，考慮到相關(guān)雜質(zhì)吸收干擾和紫外檢測(cè)器最適宜的波長(zhǎng)范圍，我們最終選擇了276nm為血根堿液相色譜的檢測(cè)波長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在此波長(zhǎng)下，血根堿吸收峰面積較大、穩(wěn)定，并且不受干擾。

色譜柱選擇常用的Nova-Pak C18反相柱。用50%乙腈水溶液溶解樣品。流動(dòng)相使用乙腈和0.1%三氟乙酸水溶液，將二者按不同比例在色譜柱上進(jìn)行試驗(yàn)，最終確定采用梯度洗脫，流速1.0mL/min，先充分分離、再快速洗脫。該條件下，有效成分與雜質(zhì)能得到很好的分離，峰形對(duì)稱，基線平穩(wěn)，并且縮短了分析時(shí)間，提高了工作效率。樣品目標(biāo)峰光譜純度為999.9(圖5)。

2.2 分析方法的線性相關(guān)性試驗(yàn) 采用倍數(shù)稀釋法，用50%乙腈水溶液稀釋標(biāo)樣儲(chǔ)備液，在82.2～328.9mg/L范圍內(nèi)準(zhǔn)確配制血根堿標(biāo)樣系列濃度溶液，在規(guī)定色譜條件下進(jìn)行方法線性范圍測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的測(cè)定結(jié)果(表2)，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(圖6)。

圖4 血根堿紫外吸收譜圖

圖5 血根堿母藥特異性譜圖

結(jié)果表明：血根堿在82.2～328.9mg/L范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系，其色譜峰面積對(duì)濃度的回歸方程為y=13.081x+76.63，R2=0.999，符合定量要求。

表2 血根堿標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的色譜測(cè)定結(jié)果

圖6 血根堿高效液相色譜標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 分析方法的精密度試驗(yàn) 從同一樣品中準(zhǔn)確稱取7個(gè)試樣，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得的變異系數(shù)(RSD)為1.07%，小于Horwitz 公式計(jì)算出的RSDr1.56%。

表3 分析方法精密度測(cè)定結(jié)果

2.4 分析方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn) 從已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36.27%的樣品中稱取3個(gè)試樣，分別添加已知濃度(65.78mg/L)的血根堿標(biāo)樣溶液2.0mL，添加濃度為26.31mg/L，進(jìn)行回收率測(cè)定，測(cè)定結(jié)果(表4)。血根堿的平均添加回收率為100.99%，SD為0.56%，RSD為0.55%。

表4 分析方法準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

實(shí)驗(yàn)建立了一種簡(jiǎn)單、快捷的分析方法來(lái)測(cè)定血根堿母藥的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。試驗(yàn)結(jié)果表明，其方法在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，方法準(zhǔn)確度和精密度均能滿足定量分析的要求，具有操作簡(jiǎn)單易行，分析快速等特點(diǎn)，是產(chǎn)品質(zhì)量控制和應(yīng)用研究中較為實(shí)用的方法。