王昌建，張鵬軒，2，馬 沛，何世成，唐小明，胡巧云，彭 志，林 源，王衛(wèi)國，劉道新

（1.湖南省動物疫病預(yù)防控制中心，湖南 長沙 410014；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南 長沙 410128；3.湖南中凈生物科技有限公司，湖南 長沙 410600）

我國畜禽養(yǎng)殖正在向集約化、規(guī)?；l(fā)展，動物疫病群防群控問題變得日益突出。在動物傳染病防控過程中，消毒是消滅病原微生物的一種重要方式，徹底消毒能夠有效切斷傳播途徑，阻斷傳染病的傳播。2018年10月非洲豬瘟傳入我國，迅速在我國范圍內(nèi)傳播，給養(yǎng)殖行業(yè)帶來了災(zāi)難性的打擊[1-3]。由于尚沒有有效疫苗和藥物防控，非洲豬瘟的防控主要依賴生物安全等級的提高，這也意味著養(yǎng)豬業(yè)對消毒技術(shù)和消毒效果提出了更高的要求[4]。

目前，市場上有各類消毒設(shè)備，大多數(shù)傳統(tǒng)消毒設(shè)備將消毒劑呈水滴或霧滴形態(tài)噴灑出去，消毒后很難具有空間性與持續(xù)性?，F(xiàn)有一種新型懸浮空間消毒技術(shù)，可將消毒劑結(jié)合增效劑形成納米噴霧，能夠均勻擴(kuò)散到消毒空間的每個角落，在空氣中懸浮時間持久，達(dá)到物體表面消毒和空間范圍內(nèi)徹底消毒的目的。因此，本研究主要評價懸浮空間消毒技術(shù)在物體表面及空間的消毒效果，驗證其懸浮消毒噴霧持續(xù)消毒的可能性，以及該技術(shù)在實際生產(chǎn)環(huán)境中消毒的效果和實用性。

1 試驗材料

1.1 消毒設(shè)備與消毒劑

使用的消毒設(shè)備為一種新型懸浮消毒機(jī)，使用的消毒劑為復(fù)方戊二醛（15%戊二醛、10%烴銨鹽）、癸甲溴銨（50%），均購自幻影三陸零農(nóng)牧科技有限公司。

1.2 主要試驗器材與試劑

超凈工作臺、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、電子天平、生化培養(yǎng)箱、移液器、金黃色葡萄球菌29213菌株、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、生理鹽水、棉拭子。

2 試驗時間、地點與方法

2.1 試驗時間與地點

試驗分為實驗室部分和豬場部分。實驗室部分試驗時間為2019年9—10月，地點是長沙市寧鄉(xiāng)高新區(qū)。豬舍部分試驗時間為2019年11—12月，地點是湖南省瀏陽市淳口鎮(zhèn)。

2.2 懸浮空間消毒技術(shù)在實驗室消毒效果及持續(xù)消毒效果的評價方法

2.2.1 制備指示菌平皿 參照《獸用消毒劑鑒定技術(shù)規(guī)范》（1992）農(nóng)（牧藥）字第101號，選用金黃色葡萄球菌29213菌株為消毒試驗指示菌。開封凍干菌種后，進(jìn)行細(xì)菌繁殖體菌懸液的制備與活菌計量，通過菌液梯度稀釋，每個稀釋度做兩個平行，在固體培養(yǎng)基上涂菌，37 ℃培養(yǎng)24 h，選平皿菌落可計數(shù)范圍在30～300個，將計數(shù)結(jié)果換算成每毫升原液的菌量。原液計數(shù)后，將菌液稀釋成所需濃度，取100 μL菌液接種到LB固體培養(yǎng)基表面，用滅菌的涂布棒涂布均勻，制備60～80個含有種子菌的平皿作為指示菌平皿。

2.2.2 試驗場地 消毒試驗選擇在兩個獨立的實驗室中進(jìn)行，實驗室1體積為54.46 cm3（長寬高為：626 cm×290 cm×300 cm），實驗室2體積為57.75 cm3（長寬高為：500 cm×350 cm×330 cm）。試驗組選用兩種消毒劑（復(fù)方戊二醛與癸甲溴銨），使用懸浮空間消毒方式分兩個實驗室同時進(jìn)行消毒；待消毒劑在實驗室徹底散除后，再次選用復(fù)方戊二醛使用常規(guī)噴灑消毒作為對照組。消毒前將房間密閉，分開放置指示菌平皿于房間內(nèi)5個不同位點，不同高度。指示菌平皿放置高度下見表1。

表1 實驗室空間放置的指示菌平皿高度

2.2.3 消毒方法 試驗所用消毒劑復(fù)方戊二醛與癸甲溴銨以及增效劑依據(jù)廠家說明，量取實驗室所需劑量。對照組常規(guī)噴灑消毒所用消毒劑依據(jù)廠家說明稀釋到相應(yīng)比例后使用噴霧消毒工具進(jìn)行噴灑；試驗組所用消毒劑無需稀釋，開機(jī)對房間進(jìn)行消毒。

2.2.4 試驗分組與設(shè)計 為比較懸浮空間消毒技術(shù)與常規(guī)噴灑消毒的消毒效果，試驗組與對照組消毒噴霧后，在固定的時間打開房間，取出和放入對應(yīng)分組的指示菌平皿。消毒時間段0～0.5 h、0～1 h，代表作用0.5 h、1 h對指示菌平皿的影響。為進(jìn)一步驗證懸浮空間消毒技術(shù)在空間與物體表面的持續(xù)消毒效果，在消毒噴霧完成1 h、2 h后，再分別放進(jìn)新的指示菌平皿消毒1 h，看空間懸浮消毒劑是否能繼續(xù)具有消毒作用，消毒時間段為1～2 h、2～3 h。試驗所用指示菌平皿分批分次放入和拿出，具體分組下見表2。

表2 指示菌平皿分組

2.2.5 平皿培養(yǎng)計數(shù) 消毒試驗結(jié)束后，將所有組的指示菌平皿與對比參照平皿，放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)后對每個平皿進(jìn)行計數(shù)，統(tǒng)計結(jié)果。

2.2.6 殺菌率判定

2.3 懸浮空間消毒技術(shù)在豬舍中消毒效果的評價方法

2.3.1 制備指示菌平皿 制備方法同2.2.1，制備20～40個含有種子菌的平皿供消毒試驗使用，準(zhǔn)備100個空的營養(yǎng)瓊脂平皿培養(yǎng)基供空氣沉降消毒試驗使用。

2.3.2 試驗場地 瀏陽市某豬場進(jìn)行試驗，試驗豬舍長200 m、寬20 m，舍內(nèi)設(shè)備配套齊全。選擇2個豬舍（圖1），豬舍A體積為98.68 m3（長寬高為2.67 m×4.2 m×8.8 m），豬舍B體積為84.00 m3（2.58 m×3.7 m×8.8 m）。每個豬舍相對密閉隔離，不對豬舍進(jìn)行前期消毒，將豬分別飼喂在2個豬舍，飼養(yǎng)1個星期后，把試驗動物趕離隔離豬舍進(jìn)行飼養(yǎng)。消毒前對畜禽圈舍進(jìn)行沖洗，沖洗干凈后空出場地用于表面消毒和空氣消毒試驗。

圖1 試驗場地平面示意

2.3.3 試驗分組 復(fù)方戊二醛組：使用懸浮空間消毒技術(shù)在密閉豬舍A內(nèi)進(jìn)行表面與空氣消毒試驗。癸甲溴銨組：使用懸浮空間消毒技術(shù)在密閉豬舍B內(nèi)進(jìn)行表面與空氣消毒試驗。

2.3.4 表面消毒試驗

（1）物體表面環(huán)境菌采樣：消毒前與消毒4 h后分別在畜禽圈舍取5個位點采樣，分別為地面2個點、食槽2個點和墻面，取樣時將棉拭子用生理鹽水浸潤后，在面積為5 cm×5 cm的地面或其他物體表面橫直各用力擦拭10次，并不斷轉(zhuǎn)換拭子擦拭面，把拭子棉花端剪入1 mL采樣液內(nèi)用力振搖100次（振蕩器30 s），將菌洗脫，洗液以生理鹽水10倍稀釋3個梯度，分別在營養(yǎng)瓊脂涂布均勻后放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后作活菌計數(shù)。

（2）物體表面指示菌試驗：消毒前在畜禽圈舍內(nèi)選擇不同高度的5個位點放置涂布有指示菌的平皿，5個點分別為欄桿高低2個位點、食槽、地面和窗臺，每個采樣點放置2個平皿，一共放置10個營養(yǎng)瓊脂平皿，消毒0.5 h、4 h后各取出一批平皿，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后作活菌計數(shù)（表3）。

表3 豬舍表面消毒指示菌平皿位置高度 cm

2.3.5 豬舍空氣細(xì)菌消毒試驗 采用平板沉降法采樣，在消毒前后圈舍內(nèi)離地面1 m的高度的不同位置放置空營養(yǎng)瓊脂平皿，打開平皿（平皿蓋至于皿底，不可仰放，防止污染），每個平皿暴露于空氣中，一共放置5個，同時放一個空的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)平皿于桌面上不啟蓋，以作對照。15 min后，依次蓋好平皿，記錄每組采樣時間，保證每組采樣時間基本一致。消毒1 h后（不開門窗）采用同樣的采樣方法、位置、次數(shù)、間隔時間、采樣時間等，采樣后的平皿置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后作活菌計數(shù)。

2.3.6 殺菌率的計算

（1）表面消毒試驗殺菌率：

（2）空氣細(xì)菌消毒試驗殺菌率：空氣細(xì)菌總數(shù)（cfu/m3）=N×50 000/（A×T）。式中：N為平皿菌落數(shù)，A為平皿面積（cm2），T為平皿暴露時間（min）。

3 試驗結(jié)果

3.1 實驗室內(nèi)兩種消毒方式殺滅指示菌結(jié)果

3.1.1 金黃色葡萄球菌原液計數(shù)結(jié)果 通過將目標(biāo)菌菌液進(jìn)行10倍的梯度稀釋，選擇合適的稀釋倍數(shù)進(jìn)行涂板、計數(shù)，最終確定的菌液中菌落數(shù)以及指示菌平皿上的菌落數(shù)如表4所示。

表4 金黃色葡萄球菌計數(shù)結(jié)果

3.1.2 兩種消毒方式的消毒效果比較 通過兩種不同消毒設(shè)備、不同消毒劑消毒噴霧后，消毒噴霧作用0.5 h、1 h對指示菌平皿的影響，最終確定這兩種消毒方式的殺菌率。結(jié)果顯示，試驗組用復(fù)方戊二醛對實驗室消毒，懸浮空間消毒的指示菌平皿在實驗室暴露0.5 h、1 h后，活菌數(shù)均為0，對指示菌殺滅率均為100%；試驗組用癸甲溴銨消毒，懸浮空間消毒的指示菌平皿在實驗室暴露0.5 h、1 h后，活菌數(shù)均為0，對指示菌殺滅率均為100%。對照組用復(fù)方戊二醛對實驗室消毒，噴壺噴灑消毒的指示菌平皿在實驗室暴露0.5 h、1 h后，活菌數(shù)均為0，對指示菌殺滅率均為100%。試驗表明，兩種消毒方式在實驗室作用0.5 h或1 h，均對指示菌有明顯的殺菌作用，殺菌率均為100%（表5）。3.1.3 兩種消毒方式消毒后持續(xù)消毒效果研究 兩種不同消毒設(shè)備、不同消毒劑分別在消毒噴霧后1 h、2 h，在實驗室5個位點再放入新的指示菌平皿，消毒噴霧作用時長為1 h，驗證懸浮的消毒噴霧是否還有消毒作用，以及消毒噴霧持續(xù)消毒效率。結(jié)果顯示，癸甲溴銨組這兩個時間點放入的指示平皿培養(yǎng)后均沒有菌落生長；復(fù)方戊二醛組使用分析懸浮消毒技術(shù)后，1 h放入的平皿沒有菌落，2 h放入的平皿有3～8個零星的菌落；常規(guī)噴灑復(fù)方戊二醛組的平皿上都長出了菌苔，大于300個菌落，見表6。

表5 懸浮空間消毒方式和噴壺噴灑消毒方式消毒結(jié)果對比

表6 兩種消毒方式持續(xù)消毒結(jié)果

試驗結(jié)果表明，常規(guī)噴灑消毒在對實驗室消毒1 h后，對新的指示菌平皿殺菌效果顯著下降，殺菌率低于98.5%；懸浮空間消毒技術(shù)在對實驗室消毒后3 h內(nèi)，仍具有較強(qiáng)的殺菌作用，對新的指示菌平皿殺菌率達(dá)到99.9%以上。

3.2 豬舍物體表面消毒與空氣消毒試驗結(jié)果

3.2.1 金黃色葡萄球菌原液計數(shù)結(jié)果 通過將菌液進(jìn)行10倍的梯度稀釋，選擇合適的稀釋倍數(shù)進(jìn)行涂板、計數(shù)，菌液濃度為1.9×109cfu/mL， 涂布指示菌平皿上的菌量為1.9×104cfu。

3.2.2 豬舍物體表面消毒試驗結(jié)果

（1）兩種消毒劑對指示菌平皿的殺菌結(jié)果。懸浮空間消毒技術(shù)使用兩種不同消毒劑，分別在密閉豬舍消毒噴霧后，消毒噴霧作用0.5 h、4 h對指示菌平皿的影響，最終確定不同消毒劑的殺菌率。結(jié)果顯示，用復(fù)方戊二醛懸浮空間消毒方式對密閉豬舍消毒，指示菌平皿在密閉豬舍暴露0.5 h，4個指示菌平皿均沒有長出菌落，1個平皿長出61個菌落；指示菌平皿在密閉豬舍暴露4 h后，5個指示菌平皿菌沒有菌落生長。懸浮空間消毒技術(shù)用癸甲溴銨消毒，指示菌平皿在密閉豬舍暴露0.5 h、4 h后，10個指示菌平皿都沒有菌落生長，表明平皿上的細(xì)菌都被殺滅（表7）。試驗表明，懸浮空間消毒技術(shù)用兩種消毒劑在密閉豬舍內(nèi)作用0.5 h，即對指示菌有明顯的殺菌作用，殺菌率均大于99%；作用4 h后，指示菌殺菌率均達(dá)到100%。

表7 豬舍環(huán)境消毒后指示菌計數(shù)結(jié)果

（2）兩種消毒劑對物體表面菌的殺菌結(jié)果。用兩種不同消毒劑，分別在密閉豬舍消毒，消毒前后分別在食槽、墻面、地面等地方采樣、培養(yǎng)細(xì)菌后計數(shù)，計算出取樣面積內(nèi)的菌量，計算確定不同消毒劑的對密閉豬舍不同位置物體表面菌的殺菌率。結(jié)果顯示，用復(fù)方戊二醛消毒劑采用懸浮空間消毒的方式對密閉豬舍消毒，對地面上細(xì)菌殺滅率均能達(dá)到97.6%以上，對墻面上細(xì)菌殺滅率均能達(dá)到99.6%以上，對食槽上細(xì)菌殺滅率能達(dá)到100%。消毒對豬舍物體表面菌的殺菌率平均能達(dá)到99%以上。

懸浮空間消毒設(shè)備用癸甲溴銨消毒劑對密閉豬舍消毒，對地面上細(xì)菌殺滅率均能達(dá)到98.2%以上，對墻面上細(xì)菌殺滅率均能達(dá)到95.6%以上，對食槽上細(xì)菌殺滅率能達(dá)到99.2%以上。消毒對豬舍物體表面菌的殺菌率平均能達(dá)到98%以上（表8）。

表8 豬舍消毒后物體表面的指示菌計數(shù)結(jié)果

試驗表明，懸浮空間消毒技術(shù)用兩種消毒劑在密閉豬舍內(nèi)消毒后，即對豬舍地面、墻面、食槽等表面菌有明顯的殺菌作用，殺菌率均大于98%。

3.2.3 豬舍空氣消毒試驗結(jié)果 使用兩種不同消毒劑，分別在密閉豬舍消毒，消毒前后分別在圈舍內(nèi)離地面1 m高的5個位點放置無菌營養(yǎng)瓊脂平皿、培養(yǎng)細(xì)菌后計數(shù)，計算確定不同消毒劑對密閉豬舍空氣中細(xì)菌的殺菌率。結(jié)果顯示，懸浮空間消毒技術(shù)采用復(fù)方戊二醛消毒劑對密閉豬舍消毒，消毒前空氣中的平均菌數(shù)為8.5×103cfu/cm3，消毒后空氣中的平均菌數(shù)為1.8×102cfu/cm3。消毒對空氣中細(xì)菌的殺菌率能達(dá)到97.9%以上。懸浮空間消毒技術(shù)采用癸甲溴銨消毒劑對密閉豬舍消毒，消毒前空氣中的平均菌數(shù)為5.8×103cfu/cm3，消毒后空氣中的平均菌數(shù)為4.6×102cfu/cm3。消毒對空氣中細(xì)菌的殺菌率能達(dá)到92.1%以上（表9）。

表9 豬舍消毒后舍內(nèi)空氣菌計數(shù)

試驗表明，應(yīng)用懸浮空間消毒技術(shù)經(jīng)兩種消毒劑在密閉豬舍內(nèi)消毒后，對豬舍空氣中細(xì)菌有明顯的殺菌作用，均能達(dá)到90%以上，復(fù)方戊二醛對空氣中細(xì)菌的殺菌作用略為明顯。

4 討論

隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，生物安全問題在豬場養(yǎng)殖業(yè)中愈發(fā)重要，高效高質(zhì)量的消毒設(shè)備更能為豬群健康成長保駕護(hù)航。本研究通過實驗室與豬舍消毒試驗，對一種新型的懸浮空間消毒技術(shù)的殺菌效能、適用性進(jìn)行評價研究，結(jié)果顯示其在實驗室和豬舍對于物體表面和空間都有很好的消毒效果。

該技術(shù)與傳統(tǒng)噴灑或超聲波的消毒方式相比較，創(chuàng)新之處在于增加了增效劑，集成微泵技術(shù)將常用的化學(xué)消毒劑形成懸浮狀消毒噴霧，消毒噴霧可以充滿消毒的空間，并在空間內(nèi)長時間懸浮，通過調(diào)節(jié)消毒劑噴霧的濃度和消毒的有效作用時間，可以達(dá)到預(yù)期的消毒效果。這種消毒方式將消毒劑最大程度地送到空間每個接觸面，還能實現(xiàn)消毒劑在空間長時間懸浮，實現(xiàn)空間的空氣和物體表面同時消毒，解決了以往噴霧消毒作用時間不能保證、消毒面不確定是否均勻的問題，讓消毒可以做到更專業(yè)、更可控、更有效。

在當(dāng)前非洲豬瘟疫情背景下，豬病形勢嚴(yán)峻，勢必需要明確消毒效果保證豬場生物安全體系的有效執(zhí)行。新型的消毒設(shè)備可以通過控制噴射時間定量消毒劑驗證消毒效果，為豬場有效消毒提供了技術(shù)支撐和強(qiáng)效的工具。空間消毒的性能較高，可供豬場生產(chǎn)中的空間和物體表面消毒，如豬舍、倉庫、辦公室、藥品房、車輛等地方消毒使用。該設(shè)備操作簡單，一鍵啟動，應(yīng)用于生產(chǎn)一線，大幅提高了工作人員的消毒效率。