胡申才，杜艾明，李 良，張文雙，董孝元

（1.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢 430023；2.黃鶴樓酒業(yè)有限公司，湖北武漢 430050）

清香型白酒具有“清香純正，醇甜柔和，自然諧調(diào)，余味爽凈”的風(fēng)格特點，深受廣大消費(fèi)者的喜愛。酒體的風(fēng)味主要是釀造微生物群在利用原料的代謝過程中而產(chǎn)生的，因此清香型白酒的這些風(fēng)格特點既與清香型白酒的“清蒸清米查、地缸發(fā)酵、清蒸二次清”釀造工藝特點緊密相關(guān)聯(lián)[1]，也與所用大曲、原材料和酒廠所處地域有關(guān)。不同發(fā)酵工藝條件可創(chuàng)造不同的溫濕度及氧化還原等微生態(tài)環(huán)境，大米查、二米查酒醅通過混合微生物菌群進(jìn)行多微共酵,微生物群落會隨著發(fā)酵熟度的推進(jìn)而不斷演化交替。

盡管絕大多數(shù)的現(xiàn)代發(fā)酵食品是接種曲種釀造而成，但傳統(tǒng)自然發(fā)酵中的內(nèi)源性微生物常常能增強(qiáng)食品風(fēng)味的豐富度。對奶酪表皮微生物菌群的研究結(jié)果表明，至少60 %的細(xì)菌和25 %的真菌來源于環(huán)境[2]。這些與環(huán)境特異性相關(guān)的菌群在賦予產(chǎn)品明顯地域特征性方面發(fā)揮著重要作用[3]。白酒的發(fā)酵生產(chǎn)是在一個相對開放的空間里完成的，按生產(chǎn)工序來說，進(jìn)入酒醅中的微生物主要來源于大曲，但也可能會來自所使用的水源、車間空氣或墻壁及地面中的微生物[4]。白酒釀造過程中，探明不同發(fā)酵階段的酒醅釀造核心微生物菌群組成及其來源，對于研究清香型白酒發(fā)酵機(jī)制與品質(zhì)提高具有十分重要的意義。

高通量測序技術(shù)（High-throughput sequencing）一次能并行對幾十萬到幾百萬條DNA 分子進(jìn)行序列測定，可以快捷方便的讀取樣品中復(fù)雜的微生物結(jié)構(gòu)組成。近年來該技術(shù)發(fā)展迅速，可快速對混合微生物群體中原核微生物16S rRNA 或真核微生物ITS 基因的擴(kuò)增序列進(jìn)行測序分析，廣泛應(yīng)用于多菌種樣品的微生物組成分析[5-6]，從而在探明復(fù)雜樣品微生物菌群結(jié)構(gòu)組成及豐度分析方面發(fā)揮重要作用。

本文擬采用高通量測序技術(shù)對大曲、車間空氣及周圍環(huán)境和酒醅中的微生物群落構(gòu)成進(jìn)行分析，得出各大曲、車間空氣、用水及附著面環(huán)境（如墻壁和地面）等樣品中主要微生物構(gòu)成的差異，并比較分析與酒醅中主要微生物的關(guān)聯(lián)性，以期為清香型白酒發(fā)酵功能菌的篩選及應(yīng)用提供指導(dǎo)，從而釀造出質(zhì)量更好、營養(yǎng)健康價值更高的清香型白酒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲（DQ1、DQ2）、空氣樣品（KQ）、水樣（SY）及墻壁和地面等附著面（HJ）和發(fā)酵酒醅（JP0、JP5、JP7、JP14 和JP28）均來自于湖北黃鶴樓酒業(yè)有限公司的清香型白酒車間。

總DNA 提取試劑盒：土壤DNA 提取試劑盒（DNeasy PowerSoil Kit），QIAGEN公司，德國。

1.2 儀器與設(shè)備

大氣采集器：CD-1A，北京檢測儀器有限公司；超凈工作臺：SW-CJ-IFD 型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；小型臺式高速離心機(jī)：Centrifuge 5424 R型，Eppendorf；冷凍離心機(jī)：Dynamica 型；電泳儀：DYY6C 型，北京六一儀器廠；電泳槽：DYC2 型，北京六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)：英國Syngene公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 取樣方法

（1）大曲取樣：將酒廠儲存?zhèn)溆玫拇笄鬯榫鶆?，其中DQ2 為黃鶴樓酒廠的大曲，DQ1 為其他清香型白酒廠的大曲。

（2）空氣取樣[7]：在滅菌后的布氏漏斗與無菌濾紙?zhí)拙o后連接上空氣采集器，將布氏漏斗置于離地面1.5 m 高處，抽濾6 h，將濾紙上微生物用無菌生理鹽水洗滌，備用。

（3）釀造用水取樣：將車間用水1.0 L 經(jīng)無菌過濾器過濾后，將微生物濃縮富集于過濾膜，將濾紙上微生物用無菌生理鹽水洗滌，備用。

（4）墻壁和地面取樣：采用無菌棉簽擦拭墻壁和地面后，將棉簽放入無菌生理鹽水振蕩洗滌，備用。

（5）酒醅取樣：根據(jù)大米查酒釀造過程中的“前緩、中挺、后緩落”的溫度-時間變化規(guī)律，分別取發(fā)酵第0、5 d、14 d、21 d和28 d的地缸酒醅樣品，分別編號為JP0、JP5、JP7、JP14 和JP28。取樣時從地缸酒醅面下約30 cm 處，采用五點取樣法分別取中心和四周的酒醅，混勻備用。

1.3.2 樣品DNA提取

使用QIAGEN 公司的土壤DNA 提取試劑盒（DNeasy PowerSoil Kit）從樣本中提取DNA，使用Qubit?dsDNA HS Assay Kit檢測DNA濃度。

1.3.3 樣品高通量分析

樣品DNA 抽提好后，交由金唯智測序公司利用Illumina Miseq 測序平臺進(jìn)行高通量數(shù)據(jù)測定，并進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析。使用的PCR 引物由金唯智公司設(shè)計，原核生物16S rDNA 的擴(kuò)增包括V3 及V4 的2 個高度可變區(qū)，采用包含“CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”序列的上游引物和包含“GGACTACNVGGGTWTCTAATCC”序列的下游引物擴(kuò)增V3 和V4 區(qū)。真核生物ITS rDNA 的擴(kuò)增包括ITS2 可變區(qū)，采用包含“GTGAATCATCGARTC”序列的上游引物和包含“TCCTCCGCTTATTGAT”序列的下游引物擴(kuò)增ITS2區(qū)。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀釋曲線（圖1）

圖1 不同樣品的稀釋曲線分析

本研究通過Miseq 平臺擴(kuò)增子測序技術(shù)，共檢測了13 個酒醅樣品。由圖1 可知，所有樣品細(xì)菌16S rRNA 基因和真菌ITS 基因的測序都達(dá)到或接近平臺期，說明本次測序可覆蓋樣本中絕大多數(shù)微生物種群信息。

2.2 不同釀造階段酒醅中細(xì)菌群落組成分析（圖2）

圖2 酒醅樣品中原核微生物在門（A）和科（B）分類水平上的相對豐度

清香型白酒釀造過程中，隨發(fā)酵時間不同，酒醅中微生物類別會因為氧氣、pH 值和代謝產(chǎn)物等因子變化而不斷演替。通過高通量測序得出的數(shù)據(jù)可得出在門、綱、目、科、屬和種等不同分類水平上的相對豐度，在門水平上，由圖2A 可知，主要是由厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）兩大類菌組成，拌曲后的大米查入地缸后以厚壁菌門分類水平占絕對優(yōu)勢，相對豐度占比從入地缸時的17.0%到第28 天出缸的98.3%，且在5 d、14 d和21 d 的樣品中相對豐度占比均達(dá)到了71.4 %以上。在科水平上，由圖2B 可知，酒醅中原核微生物主要由乳桿菌科（Lactobacillaceae）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）和明串珠菌科（Leuconostocaceae）等組成，其中剛?cè)敫椎木契瑯悠稪P0 中還存有一類占比達(dá)到28.1 %的未知科（unclassified_unclassified）的原核微生物；隨著發(fā)酵進(jìn)程的深入，乳桿菌科微生物數(shù)量不斷增加，腸桿菌科微生物在發(fā)酵后期數(shù)量急劇減少，而明串珠菌科微生物在釀造前期得到大量增殖，也許這跟發(fā)酵前期的釀造系統(tǒng)酸性環(huán)境的快速形成有關(guān)，而入缸時占據(jù)優(yōu)勢的未知科微生物數(shù)量在發(fā)酵50 d時幾近消失。

2.3 不同釀造階段酒醅中真菌群落組成分析（圖3）

圖3 酒醅樣品中真核微生物在門（A）和科（B）分類水平上的相對豐度

一般來說在白酒釀造過程中，真核微生物的演替主要與糖化作用和酯化作用有關(guān)。從高通量測序的酒醅樣品分析結(jié)果來看（圖3），在門分類水平上，主要是由子囊菌門（Ascomycota）和接合菌門（Zygomycota）組成；在科分類水平上，主要包括毛霉科（Mucoraceae）、畢赤酵母科（Pichiaceae）、酵母科（Saccharomycetaceae）、發(fā)菌科（Trichocomaceae）、腹膜孢酵母科（Saccharomycopsidaceae）和一類酵母目中的未知科（o Saccharomycetales Unclassified）等微生物。由圖3B 可知，入缸時的酒醅主要以毛霉科的霉菌為絕對優(yōu)勢，其占比可達(dá)82.0 %；在釀造前期以霉菌糖化作用為主，分解出足量葡萄糖后，可供酵母目中的未知科和酵母科等真核微生物利用，發(fā)酵至5 d 后，毛霉科微生物占比明顯下降，但酵母目中的未知科和酵母科微生物快速增殖而明顯占據(jù)優(yōu)勢；JP5 樣品中的酵母目中的未知科占比達(dá)到了75.2 %，從7 d 直至出缸的28 d 時占比仍然一直保持在41.0%左右。

2.4 酒醅中微生物的溯源分析（圖4）

白酒釀造過程復(fù)雜，是一個“多微共酵”固態(tài)發(fā)酵過程。一般來說，清香型白酒的酒體質(zhì)量既與發(fā)酵原料、水質(zhì)有關(guān)，也與釀造微生物緊密有關(guān)。就酒醅中的發(fā)酵微生物而言，大曲粉是其主要來源，但因為釀酒工藝相關(guān)操作是在一個相對開放環(huán)境中進(jìn)行的，不可避免地會受到地面與墻壁面等環(huán)境來源微生物以及空氣和水源微生物的影響。不同的地域環(huán)境，因為溫濕度不盡相同，空氣、水體及廠房墻壁等來源的微生物種類也千差萬別。

圖4 不同樣品中原核或真核微生物在種分類水平上的分布熱圖

為了對酒醅發(fā)酵過程中的微生物進(jìn)行溯源分析，將酒醅樣品與大曲以及空氣、水體及廠房壁面的樣品中的微生物高通量測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較分析，比較后的差異度可由熱圖進(jìn)行表征，圖4A 和4B 分別表征了各個樣品中原核和真核微生物在種分類水平上的熱圖分布情況。

由2.2 所述的酒醅細(xì)菌群落組成分析結(jié)果揭示出酒醅中的原核微生物主要由腸桿菌科、乳桿菌科和明串珠菌科等組成。由圖4A可知，酒醅中含有1個屬于腸桿菌科的泛菌屬未知種（PantoeaUnclassified），在酒醅發(fā)酵的前期和中期含量可達(dá)12%～48.7 %，該菌可能來源于空氣或大曲，因為該菌廣泛分布于醬香和濃香型白酒的大曲或酒醅中[8]，該菌容易定殖于植物表面，因此該菌來源于大曲中高粱的可能性更大，且該菌也許易于飄散而釋放到廠房車間的空氣中，因此在空氣樣品中也能大量檢測得到。在不同發(fā)酵階段的酒醅中含有種類豐富的乳酸菌，如乳桿菌科中的開菲爾乳桿菌(L.kefiri)、未知乳桿菌（gLactobacillusUnclassified）、短乳桿菌(L.brevis)、副檸檬酸乳桿菌(L.paralimentarius)、清酒乳桿菌(L.sakei)、棒狀乳桿菌(L.coryniformis)、干酪乳桿菌(L.casei)、馬里乳桿菌(L.manihotivorans)和小片球菌（Pediococcus parvulus）、戊糖片球菌（P.pentosaceus），以及明串珠菌科中的明串珠菌屬未知種（gLeuconostocUnclassified）、綠色魏斯氏菌（Weissella viridescens）和魏斯氏菌屬未知種（gWeissellaUnclassified）等11 種乳酸菌。其中大多數(shù)的乳酸菌來源于酒曲，但開菲爾乳桿菌、清酒乳桿菌、棒狀乳桿菌和小片球菌可能更傾向來源于廠房中的空氣或廠房地面環(huán)境。另外，綠色魏斯氏菌酒醅來源不明，因為在空氣、水體和廠房墻壁與地面，以及大曲中含量都很少，但其發(fā)酵至5 d時的占比可達(dá)53.17%，之后數(shù)量會急劇下降，7 d 時的占比含量就降到了4.17%，推測也許因其增殖能力非常強(qiáng)而短時間內(nèi)可得到大量菌數(shù)，環(huán)境一旦改變又大量消亡。1 種涅瓦菌屬未知種(gNevskiaUnclassified)雖然在水樣中占到57.8%，但在酒醅中卻幾乎檢測不到，這也說明了菌的生長會受到酒醅環(huán)境的選擇。

圖4A 顯示出不同發(fā)酵階段的酒醅主要含有7種真核微生物，如米根霉（Rhizopus oryzae）、毛霉屬未知種（gMucorUnclassified）、扁平云假絲酵母（Candida humilis）、酵母屬未知種（gSaccharomycesUnclassified）、賽瓦酵母（Saccharomyces servazzii）、畢赤酵母屬未知種（Pichiasp 1 TMS 2011）、扣囊腹膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）。根據(jù)熱圖表征出的信息可推知扁平云假絲酵母、酵母屬未知種和毛霉屬未知種等3 種微生物更有可能是來源于空氣和水樣，賽瓦酵母來源于車間空氣，而米根霉、畢赤酵母屬未知種和扣囊腹膜孢酵母既有可能來源于大曲，也有可能來源于空氣和水樣，這可能是因為這些菌既可大量存在于空氣中，又可在水管壁上附著生長。

3 討論

不同的發(fā)酵食品有其自身不同的核心釀造微生物菌群結(jié)構(gòu)組成，這些核心微生物既為發(fā)酵食品的風(fēng)味賦予了特征性與多樣性，也為穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量提供了重要保證[9]。

在清香型白酒的發(fā)酵歷程中，不僅有酒曲中的微生物不斷交替演化生長，而且在此過程中同樣也能集成了多種環(huán)境中的復(fù)雜微生物種群。在不同發(fā)酵階段的酒醅中含有開菲爾乳桿菌(L.kefiri)、短乳桿菌(L.brevis)、副檸檬酸乳桿菌(L.paralimentarius)、清酒乳桿菌(L.sakei)、棒狀乳桿菌(L.coryniformis)等11 種乳酸菌，與山西汾酒、北京二鍋頭等清香型白酒酒醅釀造系統(tǒng)中的乳酸菌種也有著明顯差別[10]，同時也發(fā)現(xiàn)對于真核微生物來說，在酒醅釀造系統(tǒng)中，接合菌門一開始占優(yōu)勢，但逐漸被子囊菌門取代了優(yōu)勢地位，子囊菌門不僅是清香型白酒酒醅中的優(yōu)勢真菌種群，也是濃香和醬香型白酒及食醋、面包等發(fā)酵食品中的優(yōu)勢真菌種群[11]，這也符合“霉菌先行糖化作用，酵母后行產(chǎn)醇和產(chǎn)酯作用”的認(rèn)知理論，但與汾酒釀造系統(tǒng)所含有的子囊菌門酵母的種類與數(shù)量也有明顯差別[12-13]。這也從側(cè)面說明了不同酒企的清香型白酒，因為所用大曲和地域環(huán)境條件的不同，核心微生物菌群也存在明顯差別。

白酒釀造系統(tǒng)相對開放，釀造過程跟制曲過程一樣是一個“多微共酵”的過程，其中發(fā)生著復(fù)雜的生理生化反應(yīng)。迄今為止，行業(yè)內(nèi)對復(fù)雜微生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)存在著的微生物種類多樣性和代謝多樣性以及微生物各類群之間的相互作用關(guān)系還缺乏清晰的認(rèn)識。因此有必要在對釀造過程中的菌群組成進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析及溯源分析后，再結(jié)合分離培養(yǎng)技術(shù)和特征風(fēng)味物質(zhì)分析技術(shù)，進(jìn)而挖掘出核心功能微生物資源，這有利于解決因不同原料和季節(jié)差異而導(dǎo)致的酒體非均一性問題。