（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640）

巖藻黃素（fucoxanthin）又名巖藻黃質(zhì)，分子式為C42H58O6，與其他常見類胡蘿卜素（β-胡蘿卜素、蝦青素）不同，作為丙二烯類胡蘿卜素，除含特殊的共軛雙鍵外，還含有單環(huán)氧基、羰基和羥基等基團[1]。因此，巖藻黃素有極強的抗氧化性，在抗炎癥、抗癌、抗糖尿病、減肥、護肝等方面有獨特的生物活性[2]，在食品、醫(yī)藥、化妝品行業(yè)應(yīng)用價值較高。目前，商業(yè)化巖藻黃素主要從海帶（Laminaria）、枝管藻（Cladosiphon）、馬尾藻（Sargassum）、裙帶菜（Undaria）等大型褐藻中獲得，但它們的巖藻黃素含量極低，通常僅0.01～4.96 mg/g[3]，厚實的細(xì)胞壁及豐富的藻膠使其巖藻黃素提取和純化成本過高[4]。海洋硅藻三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）有生長速率高、可規(guī)?；囵B(yǎng)的優(yōu)點，同時巖藻黃素含量高達15.42～16.51 mg/g，且較易提取[5]，被公認(rèn)為藻基巖藻黃素的新來源。

目前，開放式（跑道池）和封閉式光生物反應(yīng)器（管道、柱狀、平板等）已應(yīng)用于三角褐指藻的人工培養(yǎng)[6]。但跑道池的環(huán)境因素難控制，易受敵害生物污染，生產(chǎn)效率低下；柱狀和平板反應(yīng)器大多局限于實驗室規(guī)模[7]，不利于規(guī)模化培養(yǎng)；以色列已實現(xiàn)三角褐指藻的戶外管道光反應(yīng)器規(guī)模化培養(yǎng)[8]，但依然存在戶外環(huán)境因素可控性差、生產(chǎn)性能不穩(wěn)定的問題。與戶外培養(yǎng)相比，室內(nèi)人工光源下溫度和光照易于精準(zhǔn)調(diào)控，為保障三角褐指藻的生產(chǎn)效率提供了新方向。本研究以三角褐指藻為研究對象，系統(tǒng)探討室內(nèi)管道光反應(yīng)器中不同光源和調(diào)光策略、重復(fù)補料分批培養(yǎng)和半連續(xù)培養(yǎng)條件對三角褐指藻細(xì)胞生長和巖藻黃素積累的影響，為室內(nèi)可控規(guī)?；囵B(yǎng)三角褐指藻生產(chǎn)巖藻黃素提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 藻種來源與保藏

三角褐指藻（P.tricornutumCCMP 1327）由中國科學(xué)院水生生物學(xué)研究所胡晗華研究員惠贈，藻種用f/2固體斜面培養(yǎng)基[9]保種，保存溫度4 ℃。

1.2 材料與儀器

巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品購于美國Sigma公司；海鹽購自美國Marineland公司；胰蛋白胨購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；叔丁基甲醚、甲醇為色譜純，丙酮、甘油、尿素等為分析純，均購于廣州卯林儀器有限公司；Accuri C6 流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；YMC carotenoid column C30 色譜柱購自美國Phenomenon公司；ATC鹽度計購自上海淋譽貿(mào)易有限公司；SevenEasy pH電極、DOG-209F溶氧電極、WK-206溫度電極購自上海兆福環(huán)?？萍加邢薰?；CH-ZTW臭氧發(fā)生器購自廣州創(chuàng)環(huán)臭氧電器有限公司；KCTF-100超濾膜系統(tǒng)購自仕必純貿(mào)易上海有限公司；Modulyod冷凍干燥機購自美國熱電公司；AWY-18W日光燈管購自中山市奧文照明電器有限公司；HS-5730-60LED LED燈管購自深圳華盛照明有限公司。

1.3 方法

1.3.1室內(nèi)管道光生物反應(yīng)器構(gòu)建 室內(nèi)管道光反應(yīng)器如圖1所示，由150 L PVC集氣桶、PMMA有機玻璃管（直徑10 cm，裝有比丘射流管）、光源（日光燈或LED燈）、循環(huán)水泵等組成，總體積470 L（授權(quán)中國實用新型發(fā)明專利CN201820049703.7）。藻液的超濾采收裝置由多個孔徑0.3 μm的中空纖維超濾膜組件并聯(lián)構(gòu)成。

圖1 室內(nèi)470 L管道光生物反應(yīng)器實物圖和示意圖Fig.1 Physical drawing and schematic diagram of 470-L indoor tubular photobioreactor

1.3.2培養(yǎng)條件與系統(tǒng)控制 三角褐指藻種子液培養(yǎng)采用改良的兼養(yǎng)f/2人工海水培養(yǎng)基[9]，配方：海鹽20 g/L，甘油9.20 g/L，胰蛋白胨1.17 g/L，尿素0.30 g/L，NaH2PO4·H2O 10 mg/L，Na2SiO3·9H2O 30 mg/L，F(xiàn)eCl3·6H2O 3.15 mg/L，Na2EDTA·2H2O 4.36 mg/L，CuSO4·5H2O 9.80 μg/L，Na2MoO4·2H2O 6.30 μg/L，ZnSO4·7H2O 22 μg/L，CoCl2·6H2O 10 μg/L，MnCl2·4H2O 180 μg/L。一級種子液在250 mL錐形瓶中制備（兼養(yǎng)培養(yǎng)基裝液量為100 mL），接入斜面藻苔1環(huán)培養(yǎng)至對數(shù)期。二級種子液是將一級種子液由250 mL錐形瓶轉(zhuǎn)移到2 L錐形瓶中培養(yǎng)（裝液量1 L，接種量為10%）。培養(yǎng)條件：溫度（20±1）℃，照度（3 000 ± 500）lx，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min。

在室內(nèi)管道光反應(yīng)器中，采用f/2人工海水培養(yǎng)基[9]進行自養(yǎng)培養(yǎng)（氮源為 1.76 mmol/L NH4HCO3）。對培養(yǎng)基及整個培養(yǎng)系統(tǒng)進行臭氧消毒后，接入二級種子液，接種密度為4.00×106mL-1。培養(yǎng)過程中溫度由溫度電極檢測并與空調(diào)開關(guān)相連，當(dāng)溫度超過24 ℃，開啟空調(diào)降溫；當(dāng)溫度降至20 ℃，空調(diào)自動停止。培養(yǎng)過程中pH由工業(yè)pH電極檢測，并通過減壓閥和CO2鋼瓶相連，當(dāng)pH超過8.10，減壓閥開啟通入CO2；當(dāng)pH降至7.90，減壓閥關(guān)閉停止通入CO2。培養(yǎng)過程中溶氧由溶氧電極檢測（在飽和亞硫酸鈉溶液中校零，設(shè)置20℃、空氣通氣量150 L/min條件下f/2培養(yǎng)基溶解氧為100%），并通過變頻器和水泵相連，當(dāng)溶氧超過200%，調(diào)節(jié)變頻器加大泵的流速，加速溶解氧釋放。

1.3.3室內(nèi)日光燈為光源的調(diào)光-分批培養(yǎng) 非調(diào)光組全程維持照度800 lx，調(diào)光組照度前3 d為800 lx，后5 d為3 500 lx。培養(yǎng)過程中每天取樣，并記錄pH、溶氧、溫度的變化，及時檢測細(xì)胞密度、NH3-N濃度、生物量，鏡檢三角褐指藻生長情況。藻液經(jīng)離心、洗滌3次得到藻泥，真空冷凍干燥后得到藻粉，用于測定巖藻黃素。

1.3.4室內(nèi)LED燈為光源的階段式調(diào)光-重復(fù)補料分批培養(yǎng) 日光燈和LED燈光譜數(shù)據(jù)如圖2及表1所示。比較冷白光日光燈和全光譜LED燈的光譜差異可見，二者均為白光，所以主波長較為接近，但LED燈中紅光占比較高（表1）。在自養(yǎng)條件下紅光占比更高的光源可促進三角褐指藻生物量的積累[10]。而LED燈光譜分布較為均勻，在藻類主要光合作用范圍（420～450、630～690 nm）[11]內(nèi)均有較高的絕對光譜值；日光燈光譜分布不均，并在綠光波長范圍內(nèi)擁有較高的絕對光譜值，不利于三角褐指藻中巖藻黃素的積累[12]。此外，LED燈發(fā)熱較少[11]，比日光燈節(jié)省約75%的輸入功率[13]。因此，用LED光源代替日光燈光源，通過適當(dāng)調(diào)光并配合補充氮源進行分批培養(yǎng)。

培養(yǎng)過程中階段式調(diào)節(jié)照度：10 000 lx（0～0.5 d）、3 300 lx（0.5～3 d）、6 000 lx（3～4.5 d）、5 000 lx（4.5～6 d）、10 700 lx（6～7 d）、13 000 lx (7～17 d)、5 500 lx（17～19 d）。當(dāng)NH3-N濃度低于0.88 mmol/L時補料，分別在3、7、13 d時補料，共3次。第1次補NH4HCO3至NH3-N濃度為1.76 mmol/L，第2次補氨水至NH3-N濃度為1.76 mmol/L，第3次補氨水至NH3-N濃度為2.64 mmol/L。其余培養(yǎng)條件同1.3.2。

圖2 冷白光日光燈和全光譜LED燈的光譜曲線Fig.2 Spectral curves of cold white fluorescent light and full-spectrum LED light

表1 不同光源的光譜分析Table 1 Spectral analysis of different light sources

1.3.5室內(nèi)LED燈為光源的梯度調(diào)光-重復(fù)補料半連續(xù)培養(yǎng) 采用LED燈為光源，培養(yǎng)過程中梯度調(diào)節(jié)照度：2 000 lx（0～2 d）、5 000 lx（2～4 d）、8000 lx（4～6 d）、11 000 lx（6～9 d）、14 000 lx（9～13 d）、4 000 lx（13～18 d）、7 000 lx（18～23 d）、10 000 lx（23～25 d）、14 000 lx（25～29 d）。分別在3、6、12 d時共補氨水3次，前2次補氨水到NH3-N濃度為1.76 mmol/L，第3次補氨水到NH3-N濃度為2.64 mmol/L。當(dāng)生物量超過1.57 g/L后，采收部分藻液，回用上清液，使生物量回到初始狀態(tài)，并補充氨水至NH3-N濃度為2.64 mmol/L，同時補充鐵、硅、磷等微量元素，含量達f/2培養(yǎng)基初始濃度后繼續(xù)培養(yǎng)直到采收。其余培養(yǎng)條件同1.3.2。

1.4 分析測試

各指標(biāo)分析時，每個樣品均設(shè)3個平行，取平均值并計算標(biāo)準(zhǔn)差。

1.4.1生物量[14]三角褐指藻生物量B（g/L）采用干重法測定。吸取2 mL藻液，裝于已烘干稱重的2 mL離心管中，離心，洗滌，所得藻泥放入80 ℃恒溫烘箱烘至恒重。分析天平稱量并計算差值。

1.4.2細(xì)胞密度和比生長速率[15]細(xì)胞密度（mL-1）采用流式細(xì)胞儀測定。吸取2 mL藻液于2 mL離心管中，離心、超純水洗滌，所得藻泥用超純水重懸至上機濃度，用流式細(xì)胞儀測定。

比生長速率μ（d-1）計算公式：

其中，N2和N1是時間點t2和t1的細(xì)胞密度（mL-1）。

1.4.3NH3-N濃度[14]NH3-N質(zhì)量濃度（mg/L）采用意大利HANNA HI 83200多參數(shù)水質(zhì)分析儀測定，專用試劑為HI93715。取待測上清液稀釋NH3-N至0～10 mg/L，先后滴加試劑HI93715A、HI93715B反應(yīng)后進行分析。

1.4.4巖藻黃素的提取及測定[15]稱量凍干藻粉10 mg，置入裝有適量陶瓷珠的凍存管中，加入1 mL預(yù)冷的提取液 [V(甲醇)∶V(丙酮)=1∶1）]，震蕩器震蕩30 s后，用液氮迅速冷凍，離心，收集上清液至15 mL離心管。反復(fù)多次提取直至藻粉變白。合并上清液，用氮氣吹干有機溶劑，加入定容劑[V(甲醇)∶V(叔丁基甲醚)=1∶1，含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的二丁基羥基甲苯]定容至1 mL，經(jīng)0.22 μm微濾孔膜過濾至棕色樣品瓶中，用于后續(xù)巖藻黃素檢測。

藻粉巖藻黃素含量采用高效液相色譜法（HPLC）法檢測，全程在無光或弱光下進行。HPLC系統(tǒng)采用美國Waters雙1525泵和2996二極管陣列檢測器，YMC carotenoid column C30柱（4.6 mm × 150 mm，3 μm）。流動相由甲醇(A)和叔丁基甲醚(B)組成，梯度（體積分?jǐn)?shù)）洗脫：0～6 min，95%→80% A、5%→20% B；6～12 min，80%→60% A、20%→40% B；12～19 min，60%→55% A、40%→45% B；19～20 min，55%→95% A、45%→5% B；20～23 min，95% A、5% B。流速0.80 mL/min，進樣量20 μL，440 nm下測定巖藻黃素含量。依據(jù)上述條件，按照文獻[15]建立巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析藻粉巖藻黃素含量F（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/g）、藻液巖藻黃素質(zhì)量濃度ρ（mg/L）及巖藻黃素產(chǎn)率R[mg/(L·d)]。算式：

其中，F(xiàn)和B是t時刻的巖藻黃素含量和生物量，F(xiàn)0和B0是t0時刻的巖藻黃素含量和生物量。

1.4.5數(shù)據(jù)分析 采用 Microcal Origin 8.5 Software對數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計學(xué)分析；采用t檢驗確定各組間差異，P＜ 0.05為顯著差異，P＜ 0.01為極顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 室內(nèi)日光燈光源的調(diào)光-分批培養(yǎng)三角褐指藻生長及巖藻黃素累積效率

室內(nèi)日光燈光源下三角褐指藻生長及過程參數(shù)變化見圖3。

由圖3_a可知，3 d時提高照度后，調(diào)光組細(xì)胞增長顯著提高，平臺期縮短，氨氮消耗加速。培養(yǎng)結(jié)束時，細(xì)胞密度和平均比生長速率分別達1.29×107mL-1和0.16 d-1（表2），分別是對照組的1.14倍和1.23倍（P＜ 0.05）；氨氮平均消耗速率為2.09 mg/(L·d)，是非調(diào)光組的1.14倍（P＜ 0.05）。研究表明，隨著細(xì)胞密度升高，細(xì)胞間的光遮蔽作用增強，導(dǎo)致單個細(xì)胞的照度下降[16]。因此，適當(dāng)提高照度可緩解光遮蔽，促進三角褐指藻生長[17]，加速營養(yǎng)鹽消耗。

表2 日光燈光源自養(yǎng)培養(yǎng)三角褐指藻的生產(chǎn)性能Table 2 Production capacity of P.tricornutum using fluorescent light as light source under autotrophic growth

三角褐指藻的適宜生長溫度和pH分別為15～25 ℃[18]和8.00[15]。圖3_b表明，在培養(yǎng)過程中除個別時間點外，兩培養(yǎng)組溫度基本維持在23～27 ℃，較利于三角褐指藻生長。圖3_c可見，培養(yǎng)過程中兩培養(yǎng)組pH基本維持在7.50～8.20；提高照度后（3 d時），調(diào)光組氨氮快速消耗，導(dǎo)致pH下降至7.57；6 d后氨氮消耗減慢，pH基本穩(wěn)定在8.00左右。圖3_d可見，培養(yǎng)過程中非調(diào)光組的溶解氧水平較低；而調(diào)光組溶解氧在調(diào)光后急劇增加，并5 d時達到最高值202%，5 d后，隨著細(xì)胞密度的增加，溶解氧持續(xù)下降，表明隨著光遮蔽效應(yīng)加劇，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)光合放氧作用降低[19]。

室內(nèi)日光燈下，調(diào)光對三角褐指藻生物量和巖藻黃素積累的影響見圖4。提高照度可顯著提高細(xì)胞密度，但培養(yǎng)結(jié)束時兩組生物量之間并無顯著性差異（圖4_a）。WANG等[20]在自養(yǎng)條件下發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)提高照度可顯著增加三角褐指藻生物量，與本研究結(jié)果有所差異，這可能是因為本研究中培養(yǎng)后期氨氮含量過低，限制了三角褐指藻生物量的進一步積累[21]。圖4_b表明，培養(yǎng)結(jié)束時調(diào)光組藻粉巖藻黃素含量、藻液巖藻黃素質(zhì)量濃度和巖藻黃素產(chǎn)率分別可達17.35 mg/g、9.42 mg/L和0.91 mg/(L·d)，分別比非調(diào)光組提高17.15%、17.90%和13.75%（P＜ 0.05）。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)照度從弱光提升至中等弱光時，三角褐指藻巖藻黃素含量提高42.86%[22]，與本研究結(jié)果類似。因此，在室內(nèi)日光燈光源下，提升照度可顯著促進三角褐指藻的細(xì)胞生長及巖藻黃素積累（P＜ 0.05）。

圖4 室內(nèi)日光燈階段調(diào)光對三角褐指藻生物量及藻粉巖藻黃素含量、藻液巖藻黃素濃度和巖藻黃素產(chǎn)率的影響Fig.4 Effects of the staged increase of light intensity on biomass and fucoxanthin content in alga powder,concentration in alga suspension of Phaeodactylum tricornutum and fucoxanthin productivity under indoor fluorescent light

2.2 室內(nèi)LED燈為光源的階段式調(diào)光-重復(fù)補料分批培養(yǎng)三角褐指藻生長及巖藻黃素累積效率

調(diào)光-重復(fù)補料分批培養(yǎng)的三角褐指藻生長和參數(shù)變化見圖5。由圖5_a可知，0～11 d時細(xì)胞穩(wěn)定增長，但兩次補料后氨氮消耗速率逐漸下降；11～13 d時細(xì)胞進入平臺期，此時補料，在富氮條件下積累巖藻黃素[20]；13～19 d時，細(xì)胞密度先下降后增加。培養(yǎng)結(jié)束時細(xì)胞密度和平均氨氮消耗速率分別達3.34 × 107mL-1和4.04 mg/(L·d)（表3），分別是日光燈調(diào)光組的2.60倍和1.93倍（P＜ 0.01）。

圖5 室內(nèi)LED燈下階段式調(diào)光-重復(fù)補料分批培養(yǎng)下細(xì)胞密度和NH3-N濃度及溫度、pH、照度和溶氧的變化Fig.5 Changes of cell density and NH3-N concentration,temperature,pH,light intensity and dissolved oxygen with the staged increase of light intensity and repeated fed-batch culture under indoor LED light

表3 LED燈下三角褐指藻的生產(chǎn)性能Table 3 Production capability of P.tricornutum under LED light

圖5_b可見，pH在培養(yǎng)過程中基本維持在7.60～8.10。前7 d溫度基本維持在19～22 ℃，7 d時照度升至13 000 lx后，溫度逐步升至28 ℃，導(dǎo)致細(xì)胞增長和氨氮消耗放緩（圖5_a），17 d時照度降至5 500 lx后，溫度逐漸降到23 ℃，細(xì)胞開始增長。研究表明，溫度會影響微藻酶活性及營養(yǎng)吸收[23]，因此，溫度高于25 ℃時，三角褐指藻細(xì)胞增長受抑制，甚至凋亡[18]。此外，初始照度為10 000 lx，導(dǎo)致初始溶氧高達80%。在1～3 d時，隨著照度降至3 300 lx，溶氧降至30%以下；隨著培養(yǎng)過程中照度階梯式提高，溶氧持續(xù)降低，可能因為照度提升幅度過大，使三角褐指藻受光抑制，導(dǎo)致細(xì)胞放氧活性和光合效率下降[24]。由圖6_a可知，培養(yǎng)結(jié)束時三角褐指藻的生物量和產(chǎn)率分別可達1.57 g/L和63.48 mg/(L·d)（表3），分別是日光燈調(diào)光組的2.91倍和1.31倍（P＜ 0.05）。由圖6_b可知，巖藻黃素含量在培養(yǎng)過程中呈現(xiàn)波動式變化。隨著前2 d細(xì)胞分裂加速而導(dǎo)致的快速生長，巖藻黃素含量急劇下降；3 d時補料后，巖藻黃素含量短暫上升；11 d時細(xì)胞進入平臺期（圖5_a），巖藻黃素含量快速提高，并在15 d時巖藻黃素含量最高，為17.36 mg/g，比接種時提高14.89%（P＜ 0.05）；16 d后，隨著細(xì)胞密度再次增加，巖藻黃素含量逐漸降低，但生物量快速提高，并在17 d時巖藻黃素濃度及產(chǎn)率最高，分別為24.37 mg/L、1.17 mg/(L·d)，分別是日光燈調(diào)光組的2.52倍（P＜ 0.01）和1.08倍（P＞ 0.05）。

圖6 室內(nèi)LED燈階段調(diào)光-重復(fù)補料分批培養(yǎng)對三角褐指藻生物量、藻粉巖藻黃素含量和藻液巖藻黃素濃度的影響Fig.6 Effects of the staged increase of light intensity and repeated fed-batch culture on biomass,fucoxanthin content in alga powder and concentration in alga suspension of Phaeodactylum tricornutum under indoor LED light

由此可見，與日光燈調(diào)光組相比，以LED燈為光源進行調(diào)光-重復(fù)補料分批培養(yǎng)，可極顯著強化三角褐指藻生物量和巖藻黃素含量（P＜ 0.01）。

2.3 室內(nèi)LED燈梯度調(diào)光-重復(fù)補料半連續(xù)培養(yǎng)中三角褐指藻生長及巖藻黃素累積效率

由于階段式調(diào)光條件下，照度提升幅度過大使三角褐指藻受光抑制，以及在半連續(xù)培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)基回用可減少培養(yǎng)中養(yǎng)分和水損失，降低成本，節(jié)約資源[25]，因此，進行LED燈梯度調(diào)光-重復(fù)補料半連續(xù)培養(yǎng)的實驗。

由圖7_a可知，第一階段內(nèi)細(xì)胞密度穩(wěn)定增長，在13 d時最大，為3.16×107mL-1。藻液采收及培養(yǎng)基回用進入第二階段，出現(xiàn)3 d的延滯期；隨后細(xì)胞密度開始緩慢增長，27 d后細(xì)胞進入平臺期，最終細(xì)胞密度僅為1.78×107mL-1，顯著低于第一階段（P＜ 0.05）。研究表明，在培養(yǎng)過程中三角褐指藻會產(chǎn)生大量胞外多糖分泌物[26]，而超過100 ku的胞外多糖會抑制微藻生長[27]，推測回用培養(yǎng)基中可能存在的胞外分泌物抑制了三角褐指藻的生長。此外，在第一階段，隨著細(xì)胞密度快速增加，氨氮快速消耗，其平均氨氮消耗速率可達4.38 mg/(L·d)（表3）。在第二階段前3 d，細(xì)胞處于延滯期，氨氮幾乎不消耗；隨著細(xì)胞密度的增長，氨氮開始消耗，但其平均氨氮消耗速率僅為1.74 mg/(L·d)（表3），極顯著低于第一階段（P＜ 0.01）。

圖7_b可見，培養(yǎng)過程中溫度基本在25 ℃以下，pH值基本維持在7.80～8.20，較利于三角褐指藻生長[11,14]。此外，溶氧基本維持在200%以上，可能是因為細(xì)胞可及時適應(yīng)照度梯度式增強，未受光損 傷[24]，從而使胞內(nèi)光合作用加強，溶氧不斷上升。

圖7 室內(nèi)LED燈梯度調(diào)光-重復(fù)補料半連續(xù)培養(yǎng)下細(xì)胞密度和NH3-N濃度以及溫度、pH、光照強度和溶氧的變化Fig.7 Changes of cell density and NH3-N concentration,temperature,pH,light intensity and dissolved oxygen with the gradient increase of light intensity and semi-continuous culture on under indoor LED light

三角褐指藻生物量和巖藻黃素含量及藻液巖藻黃素濃度見圖8。圖8_a表明，三角褐指藻在第一階段培養(yǎng)結(jié)束時（13 d）生物量和產(chǎn)率分別可達到1.64 g/L和105.83 mg/(L·d)。第二階段最終生物量僅為0.73 g/L，極顯著低于第一階段（P＜ 0.01）。如圖8_b所示，在兩個階段中，藻體巖藻黃素含量（干基）均先降后升。第一階段初期，隨著細(xì)胞的快速分裂，巖藻黃素含量逐漸下降；3～10 d時，巖藻黃素含量基本不變；10～12 d時，細(xì)胞進入穩(wěn)定期，巖藻黃素含量逐漸提升，并在補料后急劇上升，13 d時達到最大值17.56 mg/g，此時三角褐指藻的巖藻黃素質(zhì)量濃度和產(chǎn)率分別為28.76 mg/L（圖8_b）和1.90 mg/(L·d)（表3），分別比LED調(diào)光-重復(fù)補料分批培養(yǎng)的最高巖藻黃素濃度和產(chǎn)率提高18.01%（P＜ 0.05）和62.39%（P＜ 0.01）。第二階段培養(yǎng)初期，氮含量充足，但細(xì)胞處于延滯期，巖藻黃素含量不斷上升；15～26 d時，隨著細(xì)胞持續(xù)增長，巖藻黃素含量不斷下降；27 d后，細(xì)胞生長進入穩(wěn)定期，巖藻黃素含量急劇增加，培養(yǎng)結(jié)束時達到16.34 mg/g，與第一階段無顯著性差異，但巖藻黃素產(chǎn)率極顯著低于第一階段（P＜ 0.01）。因此，梯度調(diào)光有利于三角褐指藻生物量的積累；但培養(yǎng)基回用后，細(xì)胞生長受抑制且延滯期過長，導(dǎo)致三角褐指藻生長和巖藻黃素積累的總體效率顯著降低（P＜ 0.05）。

圖8 室內(nèi)LED燈梯度調(diào)光-重復(fù)補料半連續(xù)培養(yǎng)對三角褐指藻生物量、藻粉巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)及藻液質(zhì)量濃度的影響Fig.8 Effects of the gradient increase of light intensity and semi-continuous culture on biomass,and fucoxanthin content in alga powder,and concentration in alga suspension of Phaeodactylum tricornutum under indoor LED light

綜上所述，在優(yōu)化后的LED梯度調(diào)光-重復(fù)補料半連續(xù)培養(yǎng)模式下，三角褐指藻細(xì)胞密度、生物量，巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和產(chǎn)率分別達3.16×107mL-1、1.64 g/L、17.29 mg/g、1.90 mg/(L·d)，分別是初始日光燈非調(diào)光條件下的2.77倍、3.09倍、1.17倍和2.38倍（P＜ 0.01）。目前，三角褐指藻規(guī)?；囵B(yǎng)主要是在戶外跑道池中進行，宋培欽等[15]在戶外跑道池中分別獲得22.71 mg/(L·d)和0.53 mg/(L·d)的生物量產(chǎn)率和巖藻黃素產(chǎn)率，均明顯低于本研究；在室內(nèi)平板反應(yīng)器中，Guler等[28]自養(yǎng)培養(yǎng)三角褐指藻的最高巖藻黃素產(chǎn)率為1.10 mg/(L·d)，也明顯低于本研究的最高巖藻黃素產(chǎn)率。目前有關(guān)管道光反應(yīng)器中規(guī)模化培養(yǎng)三角褐指藻的研究基本集中在油脂積累[8,29]方面，有關(guān)巖藻黃素積累的報道較少。因此，本研究開發(fā)的室內(nèi)管道培養(yǎng)積累巖藻黃素的操作工藝有創(chuàng)新性，可顯著強化三角褐指藻的生物量和巖藻黃素積累，為室內(nèi)管道反應(yīng)器規(guī)?；囵B(yǎng)三角褐指藻生產(chǎn)巖藻黃素提供重要技術(shù)支持。

3 結(jié)語

本研究表明，在室內(nèi)管道光反應(yīng)器自養(yǎng)體系下，采用LED燈、梯度提升照度及重復(fù)補料半連續(xù)培養(yǎng)模式，可顯著促進三角褐指藻生物量和巖藻黃素產(chǎn)率，對開發(fā)建立管道反應(yīng)器中生產(chǎn)巖藻黃素的規(guī)?；囵B(yǎng)技術(shù)有重要指導(dǎo)意義。在后續(xù)研究中，需進一步探討不同光質(zhì)（紅光、藍光、綠光）及其組合對三角褐指藻生長和巖藻黃素產(chǎn)率的影響，有利于繼續(xù)提升規(guī)?；a(chǎn)巖藻黃素的效率和降低生產(chǎn)成本。