陳 東，黃翔鵠，李長玲，張 寧，韋宏杰，張玉蕾

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518108）

隨著水體富營養(yǎng)化的加劇，有害藻華（Harmful algal blooms）在世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生。其中藍(lán)藻水華最為常見，會造成嚴(yán)重的水質(zhì)問題[1]，如水體缺氧、污染飲用水和娛樂用水[2-4]，許多藍(lán)藻還會產(chǎn)生有害的藍(lán)藻毒素[5]，危害人類、牲畜、魚類甚至農(nóng)作物[6]。因此，尋找有效治理藍(lán)藻水華方法尤為迫切。

采用物理方法清除藍(lán)藻見效快，但成本相對較高，治標(biāo)不治本；化學(xué)方法是用化學(xué)制劑直接殺死藍(lán)藻，但專一性差，易造成二次污染[7]。溶藻細(xì)菌（algae-lysing bacteria）是以直接或間接方式，抑制藻類生長或殺死藻類、溶解藻細(xì)胞的細(xì)菌統(tǒng)稱[8]。溶藻細(xì)菌用于生物控藻，有安全、經(jīng)濟(jì)、特異、高效、無二次污染等優(yōu)點，已成為水質(zhì)調(diào)控的應(yīng)用熱點，有望成為生物防治水華的有效手段[9]。

藻類和藻際細(xì)菌之間存在復(fù)雜的相互抑制或促進(jìn)關(guān)系[10]。藻類分泌的胞外有機(jī)物質(zhì)，為藻際細(xì)菌的生長繁殖提供營養(yǎng)[11]；藻際細(xì)菌也可產(chǎn)生藻類生長所必需的營養(yǎng)鹽和必要的生長因子，并直接或間接促進(jìn)或抑制藻類生長[12]，甚至裂解藻細(xì)胞[13]。翟春梅等[13]從銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）細(xì)胞表面分離出一株藻際細(xì)菌甲基營養(yǎng)芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）Ma-B1，Ma-B1細(xì)胞對銅綠微囊藻的生長無顯著影響，但一定濃度的Ma-B1胞外代謝物可顯著抑制銅綠微囊藻的生長；銅綠微囊藻濾液可促進(jìn)Ma-B1的生長，而高濃度銅綠微囊藻細(xì)胞（藻菌比10∶1）則可顯著抑制Ma-B1的生長。菌藻之間復(fù)雜關(guān)系共同影響著藻、菌在自然水體中的消長。當(dāng)有利于藻類生長的細(xì)菌在藻際群落中占優(yōu)勢時，可能會促進(jìn)藻類的生長，而當(dāng)抑制藻類生長的細(xì)菌占優(yōu)勢地位時，也可能會抑制或殺死藻類。因此，研究微藻的藻際細(xì)菌可更好地探討藻類的藻際細(xì)菌動態(tài)變化，挖掘有特定功能的藻際細(xì)菌。

目前，對溶藻細(xì)菌的研究主要集中于溶藻細(xì)菌分離鑒定、溶藻現(xiàn)象的描述、溶藻方式及機(jī)理研究等[15-17]，關(guān)于溶藻細(xì)菌溶藻過程中藻類藻際微生物群落的變化鮮有報道。本課題組從湛江海濱公園水體分離出一株有溶藻效果的細(xì)菌，經(jīng)16s rDNA測序分析，鑒定為側(cè)孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus）[16]。該菌的基因組已上傳于NCBI（CP032848.1）。本研究用高通量測序方法，將單獨培養(yǎng)的銅綠微囊藻藻際微生物群落和加入溶藻細(xì)菌后的藻際微生物群落進(jìn)行對比，探究溶藻過程中藻際微生物群落的變化，為溶藻細(xì)菌的溶藻機(jī)理研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

側(cè)孢短芽孢桿菌Bl-zj（B.laterosporus）由廣東海洋大學(xué)藻類資源開發(fā)與養(yǎng)殖環(huán)境生態(tài)修復(fù)實驗室提供。銅綠微囊藻（M.aeruginosa）905購于中國科學(xué)院淡水藻種庫。

1.2 方法

1.2.1側(cè)孢短芽孢桿菌與銅綠微囊藻共培養(yǎng) 用BG11培養(yǎng)基對銅綠微囊藻905藻種進(jìn)行多次傳代與培養(yǎng)，使其形成穩(wěn)定的藻際微生物群落，并用BG11培養(yǎng)基，于25 ℃、照度1 500 lx、12 h晝/12 h夜條件下培養(yǎng)7 d，達(dá)到對數(shù)生長期。側(cè)孢短芽孢桿菌Bl-zj用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基活化擴(kuò)培，于30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)12～18 h，達(dá)到對數(shù)生長期。

將銅綠微囊藻和側(cè)孢短芽孢桿菌細(xì)胞密度均調(diào)節(jié)至1×107mL-1，分別取藻液和菌液各50 mL于1 L的錐形瓶，加BG11培養(yǎng)基至500 mL（BL組），對照組為50 mL銅綠微囊藻加BG11培養(yǎng)基至500 mL（BG組）[16]，光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后，分別離心收集共培養(yǎng)物和藻液。BL、BG組各設(shè)置3個平行實驗。

1.2.2葉綠素a測定及溶藻效率計算 分別于0、1、2、3、4 d取10 mL樣品，以5 000 r/min離心10 min，除去上清液，加入5 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，振蕩1 min，置于-20 ℃冰箱避光處理24 h后，以5 000 r/min離心10 min，取3 mL上清液分別測定于630、647、664、750 nm的光密度，葉綠素a含量（mg/L）計算[11]：

其中，D630、D647、D664和D750分別為630 nm、647 nm、664 nm和750 nm的光密度值；V1為提取液定容后體積（mL）；V2藻液體積（mL）；d為比色皿光程（cm）。

用葉綠素a含量代表銅綠微囊藻的生物量。用藻細(xì)胞去除率（R，%）作為溶藻細(xì)菌溶藻效果的參考指標(biāo)。去除率R用下式[31]計算：

其中，ρ0為對照組藻細(xì)胞葉綠素a含量；ρ1為處理組藻細(xì)胞葉綠素a含量。

1.2.3總DNA提取、文庫構(gòu)建、測序 使用土壤DNA提取試劑盒（HiPure Soil DNAKits）從樣本中提取基因組DNA后，用帶有barcode的特異引物擴(kuò)增16S rDNA的V3+V4區(qū)。引物序列為：341F：CCTACGGGNGGCWGCAG；806R：GGACTACHV GGGTATCTAAT[18]?；厥誔CR擴(kuò)增產(chǎn)物，用QuantiFluorTM熒光計定量。將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物等量混合，連接測序接頭，構(gòu)建測序文庫，Hiseq2500 PE250上機(jī)測序。測序部分委托廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行。

1.2.4數(shù)據(jù)分析 測序得到原始數(shù)據(jù)（raw reads）后，過濾低質(zhì)量讀數(shù)（Reads QC filter）[19]，組裝和再過濾，用Uparse軟件對所有樣品的全部有效標(biāo)簽（Effective Tags）序列聚類[20]，以97%的一致性將序列聚類成為OTUs（Operational Taxonomic Units），并計算每個OTU在各個樣品中的標(biāo)簽（Tags）絕對豐度和相對信息，并進(jìn)行OTU分析、物種組成分析、α多樣性分析、PICRUSt群落功能預(yù)測。α多樣性分析結(jié)果使用SPSS進(jìn)行顯著性分析。

Simpson指數(shù)（DS）計算：

其中，S表示物種種類的總數(shù)，Pi是樣品中屬于第i種的個體比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶藻細(xì)菌bl-zj對銅綠微囊藻的溶藻效果

圖1可見，與BG組相比，側(cè)孢短芽孢桿菌與銅綠微囊藻共培養(yǎng)組的銅綠微囊藻葉綠素a含量顯著減少，BG組0～4 d的葉綠素a質(zhì)量濃度從0.36 mg/L增加到1.05 mg/L，而BL組的葉綠素a質(zhì)量濃度下降至0.11 mg/L，4 d時銅綠微囊藻的去除效率達(dá)到89.55%。說明側(cè)孢短芽孢桿菌Bl-zj對銅綠微囊藻有顯著的抑制效果。

圖1 兩組銅綠微囊藻葉綠素a含量變化Fig.1 Changes of chlorophyll a content of Microcystis aeruginosa in two groups

2.2 OTU分析

2組樣品獲得高質(zhì)量質(zhì)控序列平均為85 390條，共聚成946個OTU，依據(jù)劃分的OTU，比較兩組樣品間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性。在PCA圖中，OTU的距離越近，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性越高，而不同環(huán)境間的樣品往往表現(xiàn)出各自聚集的分布情況。圖2表明，菌藻混合培養(yǎng)BL組和藻單獨培養(yǎng)BG組聚集在不同的區(qū)域內(nèi)，BL組聚集在右側(cè)，而BG組在左側(cè)，構(gòu)成兩個獨立的組群[21]，表明與側(cè)孢短芽孢桿菌Bl-zj共培養(yǎng)的銅綠微囊藻微生物組成和單獨培養(yǎng)的銅綠微囊藻微生物組成有明顯差異，這在銅綠微囊藻藻際微生物群落韋恩圖（圖3）中更為直觀，兩組相同的OTU有187個，BG組獨有的OTU有420個，BL組獨有的OTU有339個，雖然兩組的微生物群落組成有相同之處，但差異已達(dá)50 %以上，顯然是兩個不同的微生物群落。

圖2 銅綠微囊藻微生物群落結(jié)構(gòu)的主要成分分析Fig.2 Principal component analysis of microbial community structure of Microcystis aeruginosa

圖3 銅綠微囊藻微生物群落韋恩圖Fig.3 Venn map of Microcystis aeruginosa microbial community

2.3 銅綠微囊藻微生物群落物種組成分析

優(yōu)勢物種很大程度決定著微生物群落的生態(tài)結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)，了解群落在各個水平的物種組成情況可有效解讀群落結(jié)構(gòu)的形成、改變及生態(tài)影響等。BL組共鑒定出23目，BG組共鑒定出24目，兩組相對豐度前10的類群見圖4_a。在BG組中，除去銅綠微囊藻所屬的色球藻目（Chroococcales，70.48%），相對豐度較高的是根瘤菌目（Rhizobiales，6.32%）、醋桿菌目（Acetobacterales，5.96%）、假單胞菌目（Pseudomonadales，5.67%）和柄桿菌目（Caulobacterales，5.85%）。而在BL組中，相對豐度最高的是側(cè)孢短芽孢桿菌所屬的芽孢桿菌目（Bacillales），平均占比高達(dá)94.06%，色球藻目占比4.9%，其他類別不到2%。兩組樣品的微生物群落組成明顯不同。

在樣品屬水平上，BL組共鑒定出35屬，BG組共鑒定出39屬，兩組相對豐度前十的類群如圖4_b所示。在BG組中，除去藻類（Microcystis，70.48%）和未分類（Unclassified，13.48%），相對豐度值最高的是假單胞菌屬（Pseudomonas，4.91%），其余相對豐度由高到低分別為中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium，3.18%）、短芽孢桿菌屬（Brevibacillus，1.97%）和紅桿菌屬（Rhodobacter，1.48%）。而樣品 BL 中短芽孢桿菌屬（Brevibacillus，94.06%）占據(jù)絕對優(yōu)勢，與上述目水平分析相符合。

根據(jù)各物種目和屬匯聚的豐度數(shù)據(jù)，將各物種在樣品中的表達(dá)狀況表現(xiàn)在熱圖中，根據(jù)熱圖上的物種聚類關(guān)系，可反映物種分布規(guī)律[22]。圖5顯示，在BL組，除側(cè)孢短芽孢桿菌Bl-zj外的物種豐度顯著降低，與BG組形成鮮明對比，說明側(cè)孢短芽孢桿菌Bl-zj與銅綠微囊藻共培養(yǎng)會造成銅綠微囊藻微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生巨大變化，可破壞甚至消滅銅綠微囊藻原有的附生菌群。

2.4 銅綠微囊藻微生物群落物種多樣性分析

α多樣性是反映群落物種豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)。Sobs表示樣本中觀察到的物種數(shù)目。由表1可見，BG組的Sobs值高于BL組，表明BG組觀察到的物種數(shù)目高于BL組。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映群落多樣性。Shannon和Simpson指數(shù)越高，則群落多樣性越高。表1表明，BG組的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均顯著高于BL組，說明BG組中的生物多樣性高于BL組。Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)反映群落豐富度，Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高。BG組的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均明顯高于BL組，說明BG組中的生物群落豐富度高于BL組。所有樣本的覆蓋率均大于99%，說明測序?qū)ξ锓N的覆蓋率較大，樣本中未檢測到序列的概率極低，證明測序結(jié)果可靠性高，可代表樣本中微生物的真實情況。

圖4 銅綠微囊藻微生物群落目（a）、屬（b）水平種群分布Fig.4 Microbial community population distribution of Microcystis aeruginosa at the order (a) and genus (b) level

圖5 銅綠微囊藻微生物群落目（a）、屬（b）水平熱圖Fig.5 Microbial community heatmap of Microcystis aeruginosaat the order (a) and genus (b) level

表1 銅綠微囊藻微生物群落物種Alpha多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity index of microbial community of Microcystis aeruginosa

2.5 銅綠微囊藻藻際細(xì)菌功能預(yù)測

通過PICRUSt功能預(yù)測分析，比對KEGG數(shù)據(jù)庫，獲得153個代謝通路信息，將其劃分至6種主要通路信息：基因信息處理（Genetic information processing）、環(huán)境信息處理（Environmental information processing）、新陳代謝（Metabolism）、細(xì)胞進(jìn)程（Cellular processes）、組織系統(tǒng)（Organismal systems）和人類疾?。℉uman diseases）。其中與新陳代謝相關(guān)的基因豐度占比最高，人類疾病基因豐度占比最低。兩組樣品各代謝通路相關(guān)的基因豐度占比排名有一致性，基因豐度由大到小均依次為新陳代謝、基因信息處理、細(xì)胞進(jìn)程、環(huán)境信息處理、組織系統(tǒng)和人類疾病。通過比對IMG（Integrated Microbial Genomes）數(shù)據(jù)庫整理出20種功能分類（表2），其中基因豐度排名前 10由大到小依次為碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism）、氨基酸代謝（Amino acid metabolism）、脂質(zhì)代謝（Lipid metabolism）、能量代謝（Energy metabolism）、外源生物降解與代謝（Xenobiotics biodegradation and metabolism）、復(fù)制與修復(fù)（Replication and repair）、細(xì)胞運動（Cell motility）、膜轉(zhuǎn)運（Membrane transport）、核苷酸代謝（Nucleotide metabolism）和信號傳導(dǎo)（Signal transduction）。圖6可見，BG組和BL組的基因豐度有明顯差異，在基因豐度前15的代謝通路中，除外源生物降解與代謝、能量代謝、細(xì)胞群落-原核生物外，BL組中各功能基因豐度均大于BG組，而BG組中細(xì)菌群落功能側(cè)重外源生物降解與代謝以及能量代謝，也體現(xiàn)出菌藻間的能量物質(zhì)交換。

圖6 銅綠微囊藻微生物群落細(xì)菌的KEGG代謝通路相對豐度Fig.6 Relative abundance of KEGG metabolic pathway of Microcystis aeruginosa microbial community

3 討論

本研究中，銅綠微囊藻905的藻際細(xì)菌以假單胞菌屬（Pseudomonas）為優(yōu)勢屬，中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）為次優(yōu)勢屬。肖慧杰[23]在兩株水華微囊藻（Microcystis flos-aquae,NJ-159，NJ-72）群體狀態(tài)和一株惠氏微囊藻（Microcystis wesenbergii,NJ-24）單細(xì)胞狀態(tài)下也發(fā)現(xiàn)了假單胞菌屬，但不是優(yōu)勢屬。周子元等[24]從太湖微囊藻中分離出三株假單胞菌和一株芽孢桿菌，與本研究結(jié)果較為吻合，本研究中也發(fā)現(xiàn)了短芽胞桿菌屬（Brevibacillus）。過七根等[25]在銅綠微囊藻905鑒定出35株細(xì)菌，其中假單胞菌屬和紅細(xì)菌屬本研究也有發(fā)現(xiàn)。范琦等[26]發(fā)現(xiàn)，銅綠微囊藻NJ-177的附生菌群中鞘氨醇單胞菌屬為優(yōu)勢屬，占附生細(xì)菌的40 %。Shi等[27]也在銅綠微囊藻附生菌群發(fā)現(xiàn)鞘氨醇單胞菌屬，且為優(yōu)勢屬。而在李孟珂[28]的研究中，銅綠微囊藻藻際細(xì)菌以氣微菌屬為優(yōu)勢屬，未分離到鞘氨醇單胞菌屬，也未分離出假單胞菌屬。不同微囊藻的附生菌群可能存在一定共性，但更多的是差異。附著在藻類上的代謝能力、疏水性、自聚和共聚等細(xì)菌特性也會對藻際環(huán)境造成影響，這也是決定附生菌群種類組成的重要因素[29]。朱麗萍等[13]證實，相對于水體中的浮游細(xì)菌，附著在藻類群體上的細(xì)菌種群代謝活性更高。范琦等[26]也證實，在惠氏微囊藻（M.wesenbergii）、堅實微囊藻（Microcystis firma）、水華微囊藻（M.flos-aquae）和銅綠微囊藻（M.aeruginosa）的藻際環(huán)境中，附著細(xì)菌的特性有差異，細(xì)菌共聚能力不同，導(dǎo)致不同藻際環(huán)境中的優(yōu)勢菌種產(chǎn)生變化。

本研究中，側(cè)孢短芽孢桿菌Bl-zj是一株溶藻細(xì)菌。研究證明，Bl-zj主要通過分泌胞外活性物質(zhì)殺死藍(lán)藻[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，在溶藻過程中，Bl-zj破壞了銅綠微囊藻的藻際細(xì)菌群落，可能在溶藻過程中，某些對銅綠微囊藻生長有利的細(xì)菌受到Bl-zj的抑制，使銅綠微囊藻的營養(yǎng)吸收或其他方面受到負(fù)面影響，這可能輔助了Bl-zj的溶藻進(jìn)程。研究證明，在藍(lán)藻周邊環(huán)境附生的細(xì)菌群落可保護(hù)宿主藻細(xì)胞免受外界不良物質(zhì)的侵害，細(xì)菌群落還可直接或間接地處理掉較多代謝廢物，促進(jìn)藻細(xì)胞的健康發(fā)育[28]。鄒迪等[30]研究發(fā)現(xiàn)，藻際細(xì)菌假單胞菌可促進(jìn)對數(shù)期銅綠微囊藻細(xì)胞的生長，假單胞菌對水體中的含磷細(xì)胞物質(zhì)進(jìn)行吸收利用，再分解為磷酸鹽提供給微囊藻。Jiang等[31]也發(fā)現(xiàn)，磷在銅綠微囊藻及其藻際細(xì)菌假單胞菌間可以轉(zhuǎn)移，當(dāng)銅綠微囊藻的生長進(jìn)入滯后期，藻際細(xì)菌可釋放大量的磷，使微囊藻的同化較易進(jìn)行。另外，一些研究表明，假單胞菌屬菌株有降解烷基酚類和芳香族化合物等持久性有機(jī)污染物的能力，紫桿菌屬菌株也具有降解芳香烴和石油等合成有機(jī)物的能力[32]。在藻際環(huán)境穩(wěn)定的情況下，一些藻際細(xì)菌可與藻類進(jìn)行物質(zhì)交換，為藻類生長提供營養(yǎng)，一些藻際細(xì)菌可分解有害物質(zhì)，保護(hù)藻類和藻際環(huán)境的穩(wěn)定。但是側(cè)孢短芽孢桿菌Bl-zj的加入，使藻際細(xì)菌多樣性顯著下降，芽孢桿菌屬細(xì)菌成為優(yōu)勢屬，抑制甚至消滅了其他藻際細(xì)菌，對銅綠微囊藻的藻際環(huán)境造成巨大的破壞。可能是由于生態(tài)位的競爭和替代，或者是Bl-zj分泌的胞外物質(zhì)對其他藻際細(xì)菌也有抑制效果。藻際環(huán)境的破壞以及對銅綠微囊藻生長有益的藻際細(xì)菌消失可能導(dǎo)致銅綠微囊藻生長所需營養(yǎng)物質(zhì)短缺，加速了銅綠微囊藻衰亡進(jìn)程。

本研究中，側(cè)孢短芽孢桿菌Bl-zj對藻際環(huán)境的細(xì)菌群落有較強(qiáng)的破壞作用，與BG組相比，BL組中細(xì)菌多樣性顯著降低，這也為研發(fā)新型除藻劑或控制有害藻類提供新思路：通過破壞藻際環(huán)境平衡，使有抑藻效果的細(xì)菌成為藻際微生物群落優(yōu)勢群體的手段而達(dá)到溶藻效果。這需要更加深入地研究藻際細(xì)菌的變化對銅綠微囊藻的影響，以及菌藻之間的相互作用機(jī)理等。本研究中，細(xì)菌培養(yǎng)基的加入是否會對藻際細(xì)菌組成造成影響，是進(jìn)一步研究中需注意的問題。