甄曉敏 ，王培偉 ，2，崔金剛 ，2，張 騰 ，2＊＊，陳 瑜 ，2＊＊

（1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 上海 200437；2. 上海市中醫(yī)藥研究院中西醫(yī)結(jié)合臨床研究所 上海 200437）

目前我國高血壓患病人數(shù)達2.45 億，僅45.8%的人接受了治療，得到有效控制的僅占16.8%[1]。臨床上雖然有多種類型降壓藥物可供選擇，包括鈣離子拮抗劑、血管轉(zhuǎn)換酶抑制劑、利尿劑、β受體阻滯劑等，但仍有大量難以有效控制的高血壓患者存在[2]，基于高血壓病理形成相關(guān)機制的新的防治藥物的研究具有重要的臨床意義。近年來研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)炎癥參與了高血壓的病理過程，尤其是PVN（下丘腦室旁核）區(qū)小膠質(zhì)細胞炎性激活可引起交感神經(jīng)興奮性輸出增加，導(dǎo)致高血壓形成和發(fā)展[3-6]。PVN 區(qū)主導(dǎo)自主神經(jīng)腦區(qū)，整合來自腦干和室周器的信號，通過延髓頭端腹外側(cè)及脊柱中外側(cè)柱將交感神經(jīng)信號向周圍傳出，作用于心臟、血管、腎臟等效應(yīng)器，引起血壓改變[7,8]。中藥復(fù)方多靶點、多途徑的效應(yīng)模式在高血壓防治中發(fā)揮了積極的作用，進一步闡釋其血壓調(diào)節(jié)效應(yīng)的相關(guān)機制有助于科學(xué)合理的臨床應(yīng)用和推廣。

當(dāng)代諸多中醫(yī)醫(yī)家認為高血壓病屬于眩暈、頭痛范疇，病變臟腑以肝腎為主[9]。課題組張騰教授認為除“肝亢”“腎虛”的基本病機外，“風(fēng)盛”為同等重要的病機元素。參閱《蘭室秘藏》中“清空膏”與近代“三草一精湯”等組方精髓，并結(jié)合多年從事心血管疾病研究的體會及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究成果，提出清肝益腎祛風(fēng)法治療高血壓，擬清肝益腎祛風(fēng)方（以后簡稱QYQ），臨證時辨證應(yīng)用常獲良效[10]。課題組前期研究表明QYQ可顯著持久地降低自發(fā)性高血壓大鼠（Spontaneous hypertensive rat，SHR）血壓，并顯著降低系統(tǒng)性炎癥（TNF-α、Hs-CRP）及氧化應(yīng)激（ROS）反應(yīng)[11]，但QYQ能否抑制神經(jīng)炎癥尚不清楚。

本研究以血管緊張素II（Ang II）誘導(dǎo)的高血壓小鼠為研究對象，并從QYQ對PVN區(qū)神經(jīng)炎癥的干預(yù)作用進行探索，進一步為QYQ 多靶點、多途徑抗高血壓效應(yīng)的生物學(xué)機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

6 周齡雄性 SPF 級 C57BL/6J 小鼠，體重（約 19-21 g），動物合格證號：SCXK（滬）2012-0002，購自斯萊克動物有限公司（上海），飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動物實驗中心（合格證：SYXK（滬）2013-0109）。在溫度18-22℃，相對濕度35-55%環(huán)境中給予光照（12 h）/暗室（12 h）交替。

1.1.2 藥物與試劑

清肝益腎祛風(fēng)方藥物組成（60 kg 成人1 日劑量）：炒黃芩15 g，夏枯草 30 g，石決明 20 g，黃連 6 g，柴胡15 g，川芎15 g，羌活15 g，防風(fēng)15 g，川牛膝15 g，黃精15 g，桑寄生15 g，均為購自中國江陰天江藥業(yè)有限公司的顆粒劑，依據(jù)體表面積用藥量換算出小鼠的用藥劑量，20 g 小鼠用藥劑量（g·kg-1）約為 60 kg 成人的 12倍[12]，使用生理鹽水作為溶媒，加熱至沸騰使顆粒劑完全溶解，每次配制7 天用量于4℃冰箱保存，每日1 次灌胃給藥。

Alzet 滲透泵，美國 ALZET?Osmotic Pumps 公司；Ang II，美國 Sigma-Aldrich 公司；Trizol 裂解液，美國Invitrogen 公司；兔抗小鼠 IBA-1，日本 WAKO 公司；綿羊抗兔二抗，英國Abcam 公司；三氯甲烷、異丙醇、曲拉通X-100，上海國藥集團化學(xué)試劑公司；無水乙醇，江蘇強盛功能化學(xué)試劑公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，日本Takara 公司；LightCycler?480 SYBR?Green I Master，美國Roche 公司；焦碳酸二乙酯（DEPC），上海生物工程有限公司。

1.1.3 儀器

電子天平（型號：FA1004B），上海精密科學(xué)儀器有限公司；動物無創(chuàng)血壓記錄儀（型號：BP-98A），北京軟隆生物技術(shù)有限公司；微量臺式離心機（型號：5418），德國Eppendorf公司；冰凍切片機（型號：CM3050S）、正置熒光顯微鏡（型號：DM6000B）、正置顯微鏡（型號：DM2000），德國Leica 公司；高速冷凍離心機（型號：Microfuge?20R），美國Beckman Coulter公司；梯度PCR擴增儀（型號：5331），德國Eppendorf公司；微量紫外分光光度計（型號：BioSpec-nano），日本Shimadzu 公司；實時熒光定量PCR 系統(tǒng)（型號：LightCycler?480II），瑞士Roche公司。

1.2 Ang II誘導(dǎo)的高血壓模型制備

按照Alzet滲透泵（型號：2004）說明書進行藥劑填充及手術(shù)操作，即根據(jù)小鼠體重及Alzet滲透泵的釋放速率計算每只小鼠對應(yīng)的滲透微泵內(nèi)Ang II 的填注量，填注Ang II（模型組，避光填注）或者等量生理鹽水（假手術(shù)對照組）；裝填完成后，將滲透泵置于生理鹽水中，經(jīng)37℃溫箱孵育過夜以激活；將8 周齡的雄性C57BL/6J 小鼠用水合氯醛（10%，300 mg·kg-1）腹腔注射麻醉，于上背部備皮，消毒后皮下植入滲透微泵。使Ang II 或生理鹽水按照 490 ng·（kg·min）-1的速率在小鼠皮下釋放4周。

1.3 動物分組與給藥

6周齡C57BL/6J雄性小鼠，給予自由進食、進水適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周，于此期間的上午時段對所有小鼠適應(yīng)性測量血壓2 次。將小鼠隨機分為3 組，每組9 只，即假手術(shù)對照組（Sham 組），模型組（Vehicle 組），清肝益腎祛風(fēng)方組（QYQ 組）。Vehicle 組及QYQ 組皮下植入含 490 ng·（kg·min）-1Ang II 的滲透泵，QYQ 組自造模后第1 日起開始給予QYQ 灌胃，而Sham 組及Vehicle組則給予同體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)28 天，第28 天20時開始禁食，于次日取材。

1.4 血壓測量

分別于造模前1 天，及造模后第7、14、28 天（± 2天）采用tail-cuff 法測量小鼠血壓。測量血壓前將小鼠在置于保溫筒內(nèi)的束縛器（由鼠袋與鼠網(wǎng)組成）中適應(yīng)15 min，保溫筒溫度設(shè)定為38℃（室溫20-25℃），待小鼠適應(yīng)并安靜之后重復(fù)測量尾袖血壓，當(dāng)測得的血壓穩(wěn)定后，取相鄰的5-6個血壓記錄。

1.5 組織切片制備

小鼠處死后使用生理鹽水經(jīng)心臟灌注，清除大腦中殘留血液。仔細解剖并取出大腦，將其置于冰面上，從矢狀面正中半切。留取左側(cè)大腦用于Real time-PCR，取材立即冷凍存于-80°C 冰箱備用。右側(cè)大腦用4%的多聚甲醛固定2 晚，固定后，用1×PBS 沖洗，放入30%蔗糖/PBS 溶液，在4°C 浸泡過夜，待組織沉底后使用 OCT 膠（Frozen section compound）包埋。包埋好的腦組織在冰凍切片機中切20 μm 厚切片（從Bregma-0.58 mm 至Bregma-1.22 mm 行連續(xù)冠狀切片），4°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 組織免疫熒光

選取PVN 中部（約Bregma-0.94 mm 處，圖1）連續(xù)3張冰凍切片，進行IBA-1免疫熒光染色，觀察PVN 區(qū)的免疫熒光染色改變情況，步驟如下：①取出切片在室溫下放置 20 min 后，用 1 × PBST（1‰ 吐溫溶于 1 ×PBS 內(nèi)）沖洗切片5 min × 3 次，脫去OCT 膠；②滴加蛋白酶K（以1∶500 比例溶于1 × PBST 內(nèi)）孵育20 min以修復(fù)抗原，后用1 × PBST 沖洗切片5 min×3 次；③滴加封閉液（1% TritonX-100 + 10%綿羊血清溶于1 ×PBST內(nèi)），放入濕盒內(nèi)室溫孵育1 h；④棄封閉液，滴加一抗兔抗小鼠IBA-1（1∶200，溶于封閉液內(nèi)），后放入濕盒，4℃過夜；⑤棄一抗后，用1×PBST沖洗5 min×3次；⑥滴加Cy3 標記的綿羊抗兔二抗（1∶600，溶于封閉液內(nèi)），室溫下孵育2 h 后，用1 × PBST 沖洗5 min ×3 次（避光）；⑦滴加DAPI 后，甘油明膠封片，避光備用。

1.7 小膠質(zhì)細胞定量分析

使用熒光顯微鏡在200 倍下放大，從IBA-1 標記的切片上獲取PVN 區(qū)圖像，使用Stereo Investigator 軟件（Micro Bright Field，Inc.，Williston，VT，USA）進行定量。使用ImageJ（1.48 v，http://imagej.nih.gov/ij）軟件分析小膠質(zhì)細胞（IBA-1+）分數(shù)面積（Fractional area）、平均熒光強度（Mean fluorescence intensity，MFI）及單位面積的胞體個數(shù)。Fractional area 是指單位面積內(nèi)免疫陽性染色面積與總面積的比值。MFI指單位面積內(nèi)免疫陽性染色光密度總和與其陽性染色面積的比值。單位面積的胞體個數(shù)，通過調(diào)整閾值和分析顆粒功能來實現(xiàn)，將閾值調(diào)整為程序自動提供的水平后再下調(diào)40點，并應(yīng)用150像素大小的過濾器，在此設(shè)定下對細胞體的數(shù)量進行計數(shù)。每只動物（Bregma-0.94 mm 左右）連續(xù)的3 張切片中的9 個視野（每視野面積200 ×200 μm2）被選取并用于統(tǒng)計分析[13-15]。

圖1 PVN區(qū)解剖位置示意圖

表1 引物序列

1.8 PVN區(qū)IL-6、TNFα mRNA的表達

取小鼠左側(cè)下丘腦（重量約為8 mg），使用Trizol裂解液提取樣品總RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent kit 將 RAN 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA；使用 SYBG 法進行 Realtime PCR 反應(yīng)，應(yīng)用 2-△△CT法處理結(jié)果，引物序列見表1。

1.9 統(tǒng)計方法

應(yīng)用GraphPad Prism（version 8.0）統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，計量資料使用均數(shù)± 標準誤（Mean ±S.E.M）表示，多組間比較采用One-way ANOVA 方差分析，進一步的兩兩比較采用Tukey's multiple comparisons test，結(jié)果取P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 QYQ 干預(yù)顯著抑制Ang II 誘導(dǎo)的小鼠收縮壓（SBP）升高

實驗過程中Sham 組小鼠收縮壓水平波動于102-119 mmHg 之間。與 Sham 組比較，Vehicle 組收縮壓從造模后第2 周開始顯著升高（P＜0.05），直到實驗結(jié)束，最高可達 149 mmHg；與 Vehicle 組比較，QYQ 組顯著抑制Ang II誘導(dǎo)的血壓升高（P＜ 0.05）（圖2）。

2.2 QYQ 干預(yù)顯著抑制Ang II 誘導(dǎo)的小鼠PVN 區(qū)小膠質(zhì)細胞激活

與 Sham 組比較，Vehicle 組 PVN 區(qū) IBA1+染色面積及強度明顯增加。與Vehicle 組比較，QYQ 組PVN 區(qū)IBA1+染色面積及強度明顯減少；定量分析顯示，與Sham 組比較，Vehicle 組 PVN 區(qū) IBA1+染色相對分數(shù)面積、相對熒光強度及相對小膠質(zhì)細胞數(shù)量均顯著升高（P＜ 0.05）。與 Vehicle 組比較，QYQ 組 PVN 區(qū) IBA1+染色相對分數(shù)面積、相對熒光強度及相對小膠質(zhì)細胞數(shù)量均顯著降低（P＜ 0.05）（圖3）。

2.3 QYQ 干預(yù)顯著抑制Ang II 誘導(dǎo)的小鼠PVN 區(qū)促炎因子mRNA的表達

與Sham 組比較，Vehicle組 PVN 區(qū)促炎因子IL-6、TNFα的 mRNA 表達水平顯著增加（P＜ 0.05）；與Vehicle 組比較，QYQ 組 PVN 區(qū)促炎因子 IL-6、TNFαmRNA表達水平顯著降低（P＜0.05）。

3 討論

圖2 QYQ的降壓效果

小膠質(zhì)細胞功能類似于外周的巨噬細胞，起源于卵黃囊中紅系髓樣前體細胞，與單核細胞由骨髓造血干細胞不斷更新不同，健康大腦中駐留的小膠質(zhì)細胞在成年期通過不斷的自我更新而持續(xù)存在。它們是保護大腦免受病原體入侵和組織損傷的第一哨兵[16]。體內(nèi)雙光子成像研究表明，小膠質(zhì)細胞的突起精細而富有可塑性，能夠在不干擾神經(jīng)元纖維細絲的情況下延伸和收縮，并以此來掃描監(jiān)視大腦內(nèi)部微環(huán)境。小膠質(zhì)細胞因此而具備快速運動能力，成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)移動最快的細胞結(jié)構(gòu)，在4 h 內(nèi)就能監(jiān)測到整個腦實質(zhì)[17,18]。小膠質(zhì)細胞對各種刺激敏感，如損傷、毒素、病原體、錯誤折疊的蛋白質(zhì)、受損的神經(jīng)元[19]，以及各種炎癥因子、促氧化因子、促高血壓因子（Ang II、鹽、醛固酮）[5,20]等。不同區(qū)域小膠質(zhì)細胞被激活后，則進一步引發(fā)生相應(yīng)的病理性改變。

圖3 PVN區(qū)IBA-1免疫熒光染色情況

研究發(fā)現(xiàn)Ang II 誘導(dǎo)的高血壓動物模型中存在PVN 區(qū)小膠質(zhì)細胞激活，使用白喉毒素靶向消耗PVN區(qū)小膠質(zhì)細胞后，可顯著減輕神經(jīng)炎癥，抑制中樞交感神經(jīng)興奮性輸出，進而實現(xiàn)降壓的目的[15]。四環(huán)素家族的米諾環(huán)素及四環(huán)素衍生物CMT-3 經(jīng)側(cè)腦室注射，能夠通過抑制PVN 區(qū)小膠質(zhì)細胞的激活而顯著降低Ang II誘導(dǎo)的血壓升高[4,5]。上述研究提示神經(jīng)炎癥在高血壓病理形成中扮演重要的角色，高血壓相關(guān)神經(jīng)炎癥機制為藥物作用機制的研究提供了新的切入點。

高血壓臨床表現(xiàn)多見肝腎陰虛、肝陽上亢，陰虛陽亢之證，QYQ 是基于高血壓陰虛陽亢、風(fēng)陽上擾之證的治療高血壓的有效方劑[10]，課題組前期研究表明QYQ 在自發(fā)性高血壓SHR 大鼠模型中具有顯著的降壓效應(yīng)[11]。然而，SHR 大鼠高血壓的發(fā)生具有復(fù)雜的遺傳因素，本研究則采用了高血壓形成機制明確的Ang II 誘導(dǎo)的小鼠高血壓模型，進一步闡明QYQ 的降壓效應(yīng)途徑及機制。研究結(jié)果首次提示QYQ 具有拮抗Ang II 誘導(dǎo)的高血壓形成的效應(yīng)。同時，本研究進一步評價了QYQ 干預(yù)對高血壓相關(guān)PVN 區(qū)小膠質(zhì)細胞激活及炎癥因子表達的影響。結(jié)果表明，QYQ 干預(yù)可顯著抑制Ang II 誘導(dǎo)的PVN 區(qū)小膠質(zhì)細胞激活、降低PVN 區(qū)炎癥因子表達水平，提示其對高血壓相關(guān)神經(jīng)炎癥的顯著干預(yù)效應(yīng)。

圖4 PVN區(qū)促炎因子mRNA表達情況

綜上，QYQ 能夠顯著抑制Ang II 誘導(dǎo)的小鼠血壓升高，同時顯著抑制PVN 區(qū)小膠質(zhì)細胞激活及該區(qū)促炎因子 IL-6、TNFαmRNA 的表達。QYQ 對神經(jīng)炎癥的調(diào)節(jié)作用可能是其防治高血壓的潛在機制之一。研究結(jié)果不僅為QYQ 防治高血壓提供了新的實驗依據(jù)，同時為中醫(yī)藥復(fù)方防治高血壓的研究提供了新的思路。