張作華 潘德麗 李 珂

山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，山東 泰安 271016

牡丹皮系毛茛科芍藥屬植物牡丹(PaenoinaSuffruticosaAndr)的根皮，性微寒，味苦，辛，歸心、肝腎經(jīng)，具有清熱涼血，活血化瘀等功效[1]。丹皮酚是牡丹皮的主要化學(xué)成分之一，具有保肝、護(hù)腎、抗炎、鎮(zhèn)定、降溫、解熱、鎮(zhèn)痛、解痙等多種藥理作用[2-4]。牡丹皮在全國大部分地區(qū)均產(chǎn)，如安徽、四川、湖南、湖北、陜西、山東、甘肅、貴州等地[5]。其中含有多種化學(xué)成分，如有機(jī)酸類、黃酮類、單萜及其苷類、三萜及其苷類、酚類及其酚苷類、揮發(fā)油等[6-8]。丹皮酚軟膏的主要成分為丹皮酚，可用于皮膚各種濕疹、皮炎、皮膚瘙癢等各種皮膚疾病，具有抗過敏、消炎止癢等作用[9-10]。目前用于丹皮酚化學(xué)成分的測(cè)定方法較多，如高效液相色譜法[11]、氣相色譜法[12]、紫外分光光度法[13]、薄層掃描法[14]等。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法對(duì)不同產(chǎn)地牡丹皮及不同廠家的丹皮酚軟膏中丹皮酚進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明，該含量測(cè)定方法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，可用于測(cè)定牡丹皮及丹皮酚軟膏中丹皮酚的含量，也為牡丹皮及丹皮酚軟膏的質(zhì)量評(píng)價(jià)和臨床應(yīng)用提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-10AT vp plus溶劑輸送泵(日本島津公司)；SPD-10A vp plus紫外-可見光檢測(cè)器(日本島津公司)，TG凱特離心機(jī)(藍(lán)城凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，KQ-500E型醫(yī)用超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，GM-0.33A津騰隔膜真空泵(天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，F(xiàn)R224CN型電子天平(奧豪斯儀器上海有限公司)。0.22 μm微孔過濾膜(有機(jī)、水)(津騰)，丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)品(110708-200505)，甲醇(色譜純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)，水(哇哈哈飲用純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)，牡丹皮(山東170501；安徽1808001)，丹皮酚軟膏廠家及批號(hào)見表1。

表1 丹皮酚軟膏廠家及批號(hào)

1.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制

精密稱取丹皮酚的對(duì)照品5 mg，置于10 mL的容量瓶中，用甲醇溶液溶解，并將其定容至刻度線，搖勻，配制成質(zhì)量濃度500 μg·mL-1的丹皮酚儲(chǔ)備液，于4 ℃下進(jìn)行保存。

1.3 牡丹皮供試品溶液的配制

將適量牡丹皮藥材粉碎，精密稱取牡丹皮粉末0.05 g，置于100 mL的容量瓶中，加甲醇溶液30 mL，超聲處理20 min，振搖后靜置冷卻至室溫后，用甲醇溶液稀釋至刻度線，溶液充分混合后，利用TG凱特離心機(jī)超速離心5 min，取上清液，用0.22 μm濾膜過濾，即得供試品溶液。

1.4 丹皮酚軟膏供試液的配制

精密稱取丹皮酚軟膏0.025 g，加甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至25 mL的容量瓶，加入20 mL的甲醇溶液，進(jìn)行超聲處理，時(shí)間為15 min，自然冷卻至室溫后，用甲醇溶液稀釋，震蕩搖勻后，取適量溶液，用0.22 μm濾膜過濾，即得供試液。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件專屬性考察

色譜柱：Hypersil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)︰水(B)=64︰36；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長：277 nm(圖1)；在該色譜條件下，丹皮酚的對(duì)照品和供試品的色譜圖分別如圖2所示，丹皮酚的保留時(shí)間(tR)為6.882 min，其理論塔板數(shù)(N)為3 043，色譜圖1所顯示的峰形良好，供試品溶液中的雜質(zhì)不干擾丹皮酚所形成的峰，專屬性高。

圖1 丹皮酚的光譜圖

圖2 丹皮酚HPLC色譜圖(a.對(duì)照品；b.牡丹皮藥材；c.丹皮酚軟膏)

2.2線性關(guān)系的考察

精密量取丹皮酚的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液(濃度是500 μg·mL-1)各0.1、0.5、1、2、3 mL，分別置于10 mL的容量瓶，用甲醇溶液稀釋至容量瓶的刻度線進(jìn)行定容，搖勻，分別精密吸取定容后的溶液20 μL，依次注入到高效液相色譜儀中，在上述色譜條件下進(jìn)行分析。記錄色譜峰，以丹皮酚對(duì)照品溶液的濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計(jì)算，可得線性回歸方程Y=88 035X+196 189(r=0.999 6)，表明丹皮酚在5～150 μg·mL-1范圍線性關(guān)系良好。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取丹皮酚對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL至50 mL的容量瓶中，震蕩搖勻之后，得到濃度是10 μg·mL-1的溶液，精密吸取體積為20 μL的溶液，注入到高效液相色譜儀中，重復(fù)分析6次，記錄在277 nm處丹皮酚的色譜圖，以峰面積計(jì)算，RSD為0.690%，表明該方法的精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取批號(hào)為170501的牡丹皮粉末0.05 g，放入10 mL的容量瓶中，用甲醇溶液稀釋至刻度線，搖勻，用超聲儀處理20 min，自然冷卻到室溫，用超速離心儀處理，取上清溶液，將樣品于0、2、4、8、12 h，分別精密吸取20 μL，依次注入液相色譜儀。記錄丹皮酚的峰面積，算得RSD為0.730%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取批號(hào)為170501的牡丹皮粉末，分別進(jìn)行精密稱取6份，每份的質(zhì)量為0.05 g，轉(zhuǎn)移至10 mL的容量瓶中，用甲醇溶液稀釋到刻度線，搖勻，超聲處理20 min，自然冷卻到室溫，離心處理10 min，取上清液。分別精密吸取20 μL，依次注入到高效液相色譜儀，得到RSD為1.903%，表明供試品溶液重復(fù)性較好。

2.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

稱取批號(hào)為170501的牡丹皮粉末0.60 g，置于100 mL的容量瓶中，用甲醇溶液稀釋至刻度線，震蕩搖勻，超聲處理20 min，自然冷卻到室溫，用甲醇溶液定容到容量瓶的刻度線，用超速離心儀處理10 min，取其上清液，將其作為供試品溶液a，精密吸取20 μL，記錄峰面積，得其濃度(122.41 μg/mL)。取丹皮酚對(duì)照品，分為低、中、高濃度(0.5、0.6、0.7 mg·mL-1)3組，每組分為3份，精密量取1 mL置于10 mL的容量瓶之中，并加入供試品溶液a，量取5 mL，用甲醇溶液稀釋至刻度，進(jìn)行搖勻和過濾，然后分別精密吸取20 μL，注入到液相色譜儀，記錄峰面積，其結(jié)果見表2，低、中、高3個(gè)濃度的RSD為0.84%，0.76%，0.75%，表明該方法的準(zhǔn)確度較高。

表2 丹皮酚的加樣回收率

2.7 樣品的含量測(cè)定

取2批牡丹皮藥材粉碎處理之后，精密稱取0.025 g，置于25 mL的容量瓶中，用甲醇溶液稀釋至刻度線，搖勻，超聲處理20 min，自然冷卻至室溫之后，用甲醇溶液補(bǔ)足到刻度線。超速離心5 min，吸取上清溶液，用濾頭過濾，分別注入液相色譜儀中。另外取7批不同廠家的丹皮酚軟膏，精密稱取0.025 g，置于25 mL的容量瓶之中，用甲醇溶液稀釋至刻度，超聲溶解15 min，自然冷卻至室溫，用甲醇溶液補(bǔ)足至刻度線，用0.22 μm濾膜過濾，分別注入液相色譜儀，記錄峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量，結(jié)果見表3，4。

表3 牡丹皮中丹皮酚的含量

表4 丹皮酚軟膏中丹皮酚的含量

3 討 論

3.1 流動(dòng)相和柱溫

通過前期實(shí)驗(yàn)條件探索過程中發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相中甲醇含量增加，流速加大和柱溫升高，均能明顯的縮短各組分的保留時(shí)間(Rt)。經(jīng)過反復(fù)的實(shí)驗(yàn)探索比較，以流動(dòng)相：甲醇-水(64︰36)，流速：1 mL·min-1，室溫(22～25 ℃)條件下，樣品供試液中丹皮酚峰與其他組分均能達(dá)到基線分離且能節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間和藥品的使用量。

3.2 檢測(cè)波長的選擇

丹皮酚的最大吸收波長為215.6 nm，其次是277.2 nm，由于供試液中含有其它成分，在215.6 nm處為末端吸收，干擾峰較多，分離效果差。所以選擇在277.2 nm附近，在試驗(yàn)過程中丹皮酚在277 nm處目標(biāo)色譜峰和其他干擾峰完全分離，互相不擾，且分離時(shí)間短，所以本實(shí)驗(yàn)選擇波長277 nm。

3.3 牡丹皮超聲提取時(shí)間的選擇

用甲醇試劑溶解藥品，超聲儀超聲提取牡丹皮藥材中丹皮酚，方法簡便易行且提取率高，經(jīng)比較不同超聲提取時(shí)間的結(jié)果表明，超聲提取20 min，丹皮酚已基本提取完全。

3.4 樣品供試液制備方法的選擇

有文獻(xiàn)報(bào)道牡丹皮中丹皮酚含量的提取主要采用水蒸氣蒸餾法、CO2超臨界流體萃取法、溶劑提取法等實(shí)驗(yàn)方法[15-16]。經(jīng)過比較分析，CO2超臨界流體萃取法能選擇性地從牡丹皮藥材中提取丹皮酚而不破壞丹皮酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而不影響丹皮酚的質(zhì)量，并且CO2易回收，對(duì)于環(huán)境幾乎沒有影響，操作成本相對(duì)較低，但是其提取的裝置價(jià)格昂貴，對(duì)于大規(guī)模提取十分不利；水蒸氣蒸餾法雖然操作也簡單、成本低，但所需時(shí)間較長沒有采用；溶劑提取法提取率較高，并且操作方便，對(duì)于本次試驗(yàn)來說比較合適。