許 慧， 高慧娟， 蔡雨衡， 蘇可欣， 劉浩杰， 程 凱

(湖北工業(yè)大學資源與環(huán)境工程學院/河湖生態(tài)修復與藻類利用湖北省重點實驗室， 武漢 430068)

自養(yǎng)氨氧化細菌(Autotrophic ammonia oxidizing bacteria，AOB)通過將氨氮轉化為亞硝氮，在氮循環(huán)中起重要作用[1-2].但由于AOB生長緩慢，代時長達8～14 h[3-10]，且受外界環(huán)境影響較大，因此氨氧化被認為是硝化反應的限速步驟[1-2].盡管AOB在絕大多數(shù)污水處理設施中的脫氮能力微弱，但其氨氧化能力突出，所積累的亞硝氮更是實施新型生物脫氮工藝(如厭氧氨氧化和短程反硝化等)的必要前提.

溫度是影響AOB代謝的重要的因素，多數(shù)AOB的適宜溫度不高于35 ℃[11-16]，僅有少量報道指出在溫泉、堆肥和原油中存在能適應高溫的AOB[17-20]：Chikako和Elena分別從堆肥和溫泉中獲得了能夠在50 ℃和55 ℃生長的AOB富集物[17-18]；Hui等也發(fā)現(xiàn)55～75 ℃的地下原油中所具有的氨氧化活性與耐熱AOB有關[20].但迄今為止，對耐熱AOB純菌種的報道僅有2例：Jones等在河口分離得到了一株AOB，其在40 ℃時的氨氧化活性最高[21]；Yoshikane等人則從熱電廠活性污泥中分離得到了一株在48 ℃仍具有氨氧化活性的AOB[22].

目前國內對于耐熱AOB的研究還很少，僅王艷等人“初步”鑒定了一株在50 ℃固體培養(yǎng)條件下生長的AOB，但該菌在液體培養(yǎng)基中的氨氧化活性非常微弱[23].顯然，高溫條件下的活性不穩(wěn)定是導致難以分離耐熱AOB的主要原因[22].考慮到印染等行業(yè)和低緯度地區(qū)夏季均存在高溫污水脫氨的需求[13]，因此值得深入研究在高溫條件下具有穩(wěn)定氨氧化活性且生長較快的AOB.

本文分離得到了一種在高溫條件下性狀穩(wěn)定的AOB富集物，研究了其最適生長溫度，測試了其在不同溫度下對不同污水的氨氧化效果，為該類型AOB的深入理論研究和實際工程應用奠定了基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

培養(yǎng)基參考Bollmann和Koops等的方法配制[24-25]，為無機自養(yǎng)培養(yǎng)基，其固體培養(yǎng)基為另加0.9%的瓊脂糖，在121 ℃濕熱滅菌20 min后備用.

1.2 富集培養(yǎng)和分離純化

生活污水采自湖北大學，按1%的比例接種于培養(yǎng)基中，27 ℃，160 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng).每7 d檢測亞硝氮積累情況，將陽性培養(yǎng)液按1%轉接至培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)3輪.再將陽性富集液涂布平板，27 ℃培養(yǎng)，由于AOB(屬于自養(yǎng)微生物)生長緩慢，需培養(yǎng)20 d后挑取單菌落進行振蕩擴培.

1.3 PCR與測序

使用HiPure Soil DNA Kit B試劑盒提取樣品DNA，使用Qubit? dsDNA HS Assay Kit檢測DNA濃度.16S rDNA的V3-V4 區(qū)的PCR擴增采用上游引物5′-CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT-3′和下游引物5′-GGACTACNVGGGTWTCTAATCC-3′[26].反應體系25 μL：TransStart Buffer 2.5 μL，dNTP混合液2 μL，上下游引物各1 μL，TransStart Taq DNA 0.5 μL，模板2 μL，超純水16 μL.反應條件為94 ℃預變性3 min，94 °C變性5 s，57 ℃退火90 s，72 ℃延伸10 s，72℃最終延伸5 min，24個循環(huán).PCR產物由江蘇金唯智生物科技有限公司高通量測序.

amoA基因的PCR擴增采用的引物為amoA-1F-GGGGTTTCTACTGGTGGT和amoA-2R-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC[27].反應體系50 μL：2×San Taq PCR Mix 25 μL，上下游引物各2 μL，模板4 μL，超純水17 μL.反應條件為95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，54 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，35循環(huán).PCR產物由生工生物工程(上海)有限公司測序.

上述測序結果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫 Blastn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對后，再采用MEGA5.1的鄰接法(Neighbor-Joining)構建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.4 溫度對富集培養(yǎng)物生長的影響

1.4.1 在培養(yǎng)基中的測試 將菌液按5%的體積比接入100 mL培養(yǎng)基中，于39 ℃，160 r·min-1搖床培養(yǎng)，每24 h取樣1 mL測定亞硝氮濃度，當亞硝氮積累速度達到50～100 mg·L-1·d-1時，將其作為接種液.將接種液按3%的體積比接種至1 300 mL培養(yǎng)基中后，再將其分裝至250 mL錐形瓶中(每瓶100 mL)，分別在34 ℃、37 ℃、40 ℃和43 ℃條件下，160 r·min-1搖床培養(yǎng)，每24 h取樣1 mL測定亞硝氮濃度(ρ，mg·L-1)，并據(jù)此計算比生長速度(μ，h-1)和代時(T，h)[3，11]：μ=(lnvn-lnvn-1)/24，其中vn為亞硝氮積累速度(mg·L-1·h-1)，其計算方法為vn=(ρt-ρt-1)/24；T=ln2/μ.

1.4.2 在垃圾滲濾液中的測試 污水為來自湖南某垃圾填埋場的垃圾滲濾液，其氨氮濃度約為400 mg·L-1.將前述1.4.1中的接種液按2%的體積比接種至1 000 mL垃圾滲濾液中，再將其分裝至250 mL錐形瓶中(每瓶100 mL)，分別在37 ℃、40 ℃和43 ℃條件下，160 r·min-1搖床培養(yǎng)，每12 h取樣測定亞硝氮濃度，對照組不接菌.

1.5 鹽度對脫氨活性的影響

向5個500 mL的錐形瓶各分裝300 mL無NaCl的培養(yǎng)基，分別加0.75 g，1.5 g，3 g，6 g和12 g的NaCl(鹽度分別為0.25%，0.5%，1%，2%，4%)，再用1 mol·L-1的鹽酸/碳酸氫鈉溶液調節(jié)pH至7.8.將調好pH的培養(yǎng)基分裝至250 mL錐形瓶中(每瓶100 mL)，按1%體積比接種菌液，27 ℃，160 r·min-1搖床培養(yǎng)至48 h取樣1 mL測氨氮，并計算相對脫氨效率(以脫氨量最大組的相對脫氨效率計為100%).

1.6 亞硝氮濃度對脫氨活性的影響

1.7 在低氨地表水中的脫氨效果

地表水來源為武漢市蘆灣湖(富營養(yǎng)化湖泊)、武泰閘(黑臭河道)和南湖港(富營養(yǎng)化河道)，向100 mL各來源的地表水接種對數(shù)期的SN-6使其初始氨氮去除速率達到約0.1 mg·L-1·h-1，對照組不接菌，150 r·min-1搖床培養(yǎng)，為了有效模擬地表水的實際情況，將培養(yǎng)溫度設為27 ℃，每天測氨氮和亞硝氮濃度.

1.8 數(shù)據(jù)分析方法

氨氮的測量使用納氏試劑分光光度法[28]，亞硝氮的測量使用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法[28]；所有試驗均設三平行，用Origin 2017 作圖，圖中的誤差量均用SE表示；用SPSS 24進行方差分析(多重比較采用LSD法)，對于部分不服從正態(tài)分布或方差齊性的數(shù)據(jù)，經(jīng)對數(shù)或者平方轉化后再進行方差分析.

2 結果與分析

2.1 富集物中的AOB種屬

經(jīng)16S rDNA高通量測序，發(fā)現(xiàn)本富集物中僅含一種AOB，其在總菌中的豐度為75%，其16S rDNA序列(Genbank序列號為MN396244，其進化樹見圖1a)與Nitrosomonasnitrosa Nm 90的同源性最高(Identity為100%)，故命名為N.nitrosaSN-6.類似的，其amoA基因序列(Genbank序列號為MN397165，其進化樹見圖1b)與N.nitrosaNm 90的同源性也高達100%.

圖1 基于部分16S rDNA序列(a)和amoA基因序列(b)的N. nitrosa SN-6的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of N. nitrosa SN-6 based on its partial 16S rDNA (a) and amoA gene (b) sequence

2.2 溫度對生長的影響

在培養(yǎng)基中，如圖2(a)，37 ℃和40 ℃更有利于亞硝氮的積累.方差分析也表明，溫度對亞硝氮濃度有顯著性影響(P<0.05)：48 h時，40 ℃的亞硝氮濃度顯著高于34 ℃、37 ℃和43 ℃(P<0.05)；72 h時，40 ℃的亞硝氮濃度顯著高于34 ℃和43 ℃，37 ℃的亞硝氮濃度也顯著高于43 ℃(P<0.05).此外，各溫度組的最大比生長速率和最短代時均出現(xiàn)在24 h～48 h，如圖2(b)，且43℃的最短代時明顯比34 ℃、37 ℃和40 ℃更長，說明最適生長溫度為34 ℃～40 ℃，方差分析也表明，溫度對能夠顯著影響最大比增長速率和最短代時(P<0.05).

圖2 不同溫度條件下培養(yǎng)基中的亞硝氮積累情況(a)及最大比生長速度和最短代時(b)Fig.2 The accumulation of (a) and the maximum specific growth rate and the minimum generation time (b) at different temperatures in media

當處理垃圾滲濾液時，各對照組幾乎不積累亞硝氮，而各試驗組不但亞硝氮積累明顯，而且氨氮降幅高于對照組，pH也顯著低于對照組(P<0.05)，均說明富集培養(yǎng)物是試驗組氨氧化的主要原因(圖3).特別是，至24 h，40 ℃實驗組的亞硝氮積累量和氨氮去除量均為最高，pH則最低(P<0.05)，均說明40 ℃為最適氨氧化溫度，這與培養(yǎng)基中測試的結果是一致的.此外，根據(jù)亞硝氮積累量計算了各溫度下的代時，也發(fā)現(xiàn)40 ℃時的代時(5.9±0.1 h) 與37 ℃(6.5±1.6 h)無顯著差異(P>0.05)，但顯著小于43 ℃(6.6±0.2 h)(P<0.05)，而，說明SN-6在垃圾滲濾液中的最適生長溫度為37 ℃～40 ℃，這也與培養(yǎng)基中獲得的結果基本吻合.

2.3 鹽度耐受性

由圖4可見，鹽度對脫氨活性有顯著性影響(P<0.05).其中鹽度0.5%時的相對脫氨效率最高(P<0.05，其氨氮降幅為52 mg·L-1)，而脫氨活性的最適鹽度為0.5%，半數(shù)抑制鹽度略高于1%，而最大耐受鹽度則大于4%.

圖4 不同鹽度下的相對脫氨效率Fig.4 Relative removal efficiency of ammonia nitrogen at different salinities

2.4 亞硝氮耐受性

由圖5可見，無亞硝氮組的相對脫氨效率最高(P<0.05，其氨氮降幅為108 mg·L-1)，脫氨活性的半數(shù)抑制亞硝氮濃度約為850 mg·L-1，完全抑制亞硝氮濃度則約為2 200 mg·L-1.

圖5 不同亞硝氮濃度下的相對脫氨效率Fig.5 Relative removal efficiency of ammonia nitrogen at different nitrite concentrations

2.5 在不同類型的低氨地表水中的脫氨效果

由圖6a可見，武漢市蘆灣湖、武泰閘和南湖港地表水中的氨氮濃度分別為5.0、15.4和22.6 mg·L-1，經(jīng)SN-6在27 ℃處理3 d后的氨氮去除速率分別可達98%、93%和98%，均明顯高于各對照組(均小于2%，P<0.05)，說明SN-6能夠使污染地表水中的氨氮濃度從Ⅴ類/劣V類標準迅速提升至Ⅱ類.此外，試驗期間的亞硝氮積累量與氨氮去除量基本相當，如圖6，說明氨氧化是SN-6在低氨地表水中的主要脫氨方式.

圖6 在不同類型低氨地表水中的脫氨效果(a)和亞硝氮積累效果(b)Fig.6 NH3-N removal effect (a) and accumulation effect (b) in different types of low-NH3-N ground water

3 討論

由于N.nitrosaSN-6與N.nitrosaNm 90的16S rDNA序列及amoA基因序列的相似度均高達100%，考慮到N.nitrosaNm 90與已知的耐熱AOB純菌株Nitrosomonassp. JPCCT2的16S rDNA序列的相似度也為100%[22]，說明N.nitrosaSN-6與耐熱的Nitrosomonassp. JPCCT2的進化關系較近.

從氨氧化活性上看(表1)，以往報道的耐熱AOB及其富集培養(yǎng)物的耐熱范圍為45 ℃～60 ℃，氨氮去除速率為1.2 mg·L-1·d-1～19.78 mg·L-1·d-1，而本文的AOB富集物的耐熱上限至少達到了43 ℃，且在37 ℃～40℃時能夠達到129 mg·L-1·d-1的最大亞硝氮積累速率，明顯高于以往的報道.

表1 不同耐熱亞硝化單胞菌在培養(yǎng)基中的氨氧化活性和生長的比較Tab.1 Comparison of ammonia-oxidizing activity and growth of different heat-resistant Nitrosomonas strains in culture media

相較于對氨氧化活性的研究，前人對耐熱AOB生長的研究則更少(表1)：Nitrosomonassp. JPCCT2的耐高溫上限雖高達48 ℃，但其最適生長溫度僅為28 ℃，且在高溫下的生長極其緩慢(如其在37 ℃時的最短代時長達7.5 d)[22].相比之下，本研究AOB富集物在37 ℃時的最大比增長速度為2.73 d-1，最短代時低至約6.1 h，說明本AOB富集物在高溫條件下的生長速度更快.

此外，即便是與常溫型的AOB相比，本富集培養(yǎng)物的代時也更短.如Nitrosomonasmobilis[3]在27 ℃的代時為10～14 h，Nitrosovibrioeuropaea[4]在27 ℃的代時為10～14 h，Nitrosospira[4]在27 ℃的代時為20～21 h，而Nitrosovibriotenuis[5]在25 ℃～30 ℃的代時為12～13 h，N.eutrophaCZ-4[10]在31 ℃的代時為8.2 h.而本AOB富集物在培養(yǎng)基中，34 ℃～40 ℃區(qū)間的最短代時均小于7.5 h；在垃圾滲濾液中，37 ℃～43 ℃區(qū)間的最短代時也均小于7 h，都明顯比已知的AOB[3-10]生長更快.

本富集培養(yǎng)物脫氨活性的半數(shù)抑制鹽度略高于1%，最大耐受鹽度則大于4%.相比之下，N.europaea19718[25]的最大耐受鹽度為2.3%，N.mobilisMs1[3]和Nitrosomonassp. JPCCT2[22]的半數(shù)抑制鹽度分別為1.46%和1.8%.而張宇坤等人對AOB富集培養(yǎng)物的研究也表明，當鹽度為0.25%和3%時，氨氧化活性分別下降了6.6%和79.2%[29]，此結果與本文的鹽度抑制效應基本相當.

本富集培養(yǎng)物脫氨活性的半數(shù)抑制亞硝氮濃度約為850 mg·L-1，完全抑制亞硝氮濃度則約為2 200 mg·L-1.考慮到游離亞硝酸(Free nitrite acid，F(xiàn)NA)是亞硝氮致毒的主要成分[6，30]，相應的半數(shù)/完全抑制FNA濃度分別為0.095 mg·L-1和0.243 mg·L-1，高于N.europaea19718[30]、N.eutrophaC91[6]及Nitrosomonassp. AL212[31]的最大FNA耐受濃度，而與N.mobilisMs1[3]及N.eutrophaCZ-4[10]相當，僅略低于N. stercoris KYUHI-S[32].較強的耐鹽能力和耐FNA能力將有助于擴展SN-6的應用范圍，也可能是該菌在垃圾滲濾液中脫氨效果明顯且生長迅速的原因.

在低氨地表水中，接種本富集培養(yǎng)物后，僅需72 h即可使超過22 mg·L-1的氨氮降至低于1.5 mg·L-1.類似的，當采用低氨親和力較高的N.eutrophaCZ-4處理黑河水時，當其脫氨速度達到0.09 mg·L-1·h-1后，約需42 h使氨氮從14 mg·L-1降至約3 mg·L-1[10]，說明SN-6同樣也具有較高的氨親和力.需要注意是，盡快通常認為氨氧化是硝化過程的限速步驟(而不是亞硝氮氧化)，但也應避免由于過量使用氨氧化菌而導致地表水大量積累的亞硝氮的情況，可以采取的措施包括嚴格控制氨氧化菌的投加量、輔助投加亞硝氮氧化菌等.

4 結論

本研究獲得的耐熱AOB富集物中的優(yōu)勢AOB菌種為N.nitrosaSN-6，其最適生長溫度為37～40 ℃(最短代時約為6 h)，最高耐受溫度不低于43 ℃，既能夠在高溫垃圾滲濾液中快速生長并脫氨，也能夠在3 d內使污染地表水中的氨氮從5～23 mg·L-1降至不超過1.5 mg·L-1.