覃喬靜 常凱利 趙仲華劉學光，3△

（1復旦大學附屬上海市第五人民醫(yī)院腎內科 上海200240；2復旦大學基礎醫(yī)學院病理學系 上海200032；3上海市腎臟疾病與血液凈化重點實驗室 上海200032；4復旦大學社區(qū)健康研究中心（籌） 上海200240）

淀粉樣變性是蛋白經(jīng)異常折疊后形成β-片層構型的淀粉樣物并發(fā)生異常沉積的一類代謝性疾病，腎臟是最常受累器官［1-2］。腎淀粉樣變性多見于中老年人，主要臨床表現(xiàn)為蛋白尿或腎病綜合征，最終進展為終末期腎病。隨著經(jīng)濟發(fā)展以及人口老齡化，慢性腎臟病的發(fā)病率及死亡率呈逐年升高的趨勢［4］，我國腎淀粉樣變性發(fā)病率已從0.56%升高至1.5%～2%［5］。

根據(jù)發(fā)生異常折疊的蛋白即前體蛋白的類型不同［1-3］，淀粉樣變性被分為不同病理分型，常見者包括AL型、AA型、遺傳性淀粉樣變性等。目前隨著基因診斷技術、蛋白質組學及質譜分析技術的發(fā)展及應用，已發(fā)現(xiàn)近36種前體蛋白［6］，因此淀粉變性的病理分型表現(xiàn)為復雜性及多樣化。腎淀粉樣變性的病理分型與臨床治療方案及判斷預后密切相關［1-3，5］，因此早期確診及明確病理分型尤為重要。我們收集了復旦大學基礎醫(yī)學院病理學系自2007年1月至2016年7月期間56例腎淀粉樣變性，對其病理形態(tài)學特點、病理分型及臨床表現(xiàn)進行總結、分析，旨在提高臨床正確診斷本病的能力、降低漏診率及誤診率。

資料和方法

病例選擇選取復旦大學基礎醫(yī)學院病理學系自2007年1月至2016年7月確診為腎淀粉樣變性的所有56例腎活檢病例，進行回顧性分析。

病理學檢查所有病例均行常規(guī)光鏡觀察，包括HE染色、PAS染色、PASM染色以 及Trichrome Masson染色；免疫熒光染色包括免疫球蛋白IgG、IgA、IgM，補體C1q、C3、C4及纖維蛋白原；剛果紅染色、偏振光顯微鏡及透射電鏡檢查。對腎小球熒光染色結果按陰性（-）、弱陽性（1+）、陽性（2+）、較強陽性（3+）、強陽性（4+）進行半定量分析。剛果紅染色切片5μm。

免疫染色對所有病例行免疫球蛋白輕鏈κ、λ及淀粉樣蛋白A（amyloid A，AA）的免疫染色。由于在2012年12月之前送檢病例均無冰凍組織，故對其石蠟切片經(jīng)兩步法SupervisionTM免疫組化檢測系統(tǒng)進行免疫組化染色；對2013年起送檢病例的冰凍組織行兩步法免疫熒光染色。所用一抗包括兔抗人κ、λ多抗（1∶500，上海優(yōu)寧維生物科技有限公司）、鼠抗人AA單抗（1∶400，美國DAKO公司）。

臨床資料分析收集患者于腎活檢時的臨床資料，包括年齡、性別、癥狀、體征、實驗室檢查等，腎臟損害指標（包括尿常規(guī)、尿蛋白定量及腎功能改變）以及腎外器官受累情況，進行回顧性分析。

統(tǒng)計學方法計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，采用GraphPad Prism 5.0軟件完成。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一般資料本研究期間，除外移植腎、重復腎活檢者，腎活檢數(shù)總計3 494例，其中56例（1.6%）確診為腎淀粉樣變性。男性31例（55.4%），女性25例（44.6%），男/女比例約為1.2。患者平均年齡為（58.6±9.3）歲（39～78歲），其中38例（67.9%）為50～69歲?；颊呔鶡o腎臟病家族史。

腎組織病理學特點HE染色顯示，淀粉樣物呈云霧狀、均質樣，弱嗜伊紅性，可廣泛沉積于腎小球、腎小管基底膜、間質及血管壁；腎小球系膜區(qū)擴大可呈結節(jié)樣改變，基膜不規(guī)則增厚伴睫毛樣突起形成。淀粉樣物經(jīng)PAS、PASM染色或Trichrome Masson染色呈弱陽性，剛果紅染色呈磚紅色，偏振光顯微鏡下呈蘋果綠折光（圖1）。

免疫熒光染色顯示，免疫球蛋白及補體在腎小球內可有不同程度的沉積，表達強度多在2+及以下，呈細顆粒樣分布于腎小球系膜區(qū)或沿毛細血管袢沉積，多數(shù)經(jīng)電鏡觀察未發(fā)現(xiàn)典型的電子致密物沉積；僅1例臨床伴有慢性淋巴細胞性白血病者，IgA及IgG分別于腎小球系膜區(qū)及沿毛細血管袢沉積，電鏡觀察分別于腎小球系膜區(qū)及上皮下區(qū)見顆粒性電子致密物沉積。電鏡檢查顯示，淀粉樣物呈纖維絲狀，排列紊亂、僵硬、不分支，直徑為8～12 nm，廣泛沉積于腎小球系膜區(qū)和基底膜、腎小球球囊壁、腎小管基底膜、間質及血管壁等處（圖1）。

圖1 腎淀粉樣變性的病理形態(tài)學Fig 1 Pathology of renal amyloidosis

病理診斷誤診情況分析4例腎組織形態(tài)改變輕微者，光鏡診斷為腎小球輕微病變，剛果紅染色陰性或可疑，經(jīng)電鏡檢查發(fā)現(xiàn)在腎小球系膜區(qū)及基膜內有直徑約10 nm的纖維絲沉積，最終確診為腎淀粉樣變性（圖2）。

圖2 早期腎淀粉樣變性Fig 2 Early renal amyloidosis

病理分型免疫染色結果顯示，56例腎淀粉樣變性中，43例（76.8%）為AL型，其中36例僅λ陽性，7例僅κ陽 性，ALλ型 與κ型之比 約 為5.1；3例（5.4%）僅AA陽性，為AA型；其余10例均為陰性，列入無法分類型。在已明確病理分型的46例中，AL型占93.5%（43/46），AA型占6.5%（3/46）。

免疫陽性染色分布于腎小球、腎小管基底膜、間質或及血管壁等，與其剛果紅染色陽性沉積部位一致。其中，12例（21.4%）僅見腎小球內沉積，包括8例ALλ型、2例ALκ型 和2例 無 法 分 類 型；11例（19.6%）僅見腎小球及血管壁沉積，包括9例ALλ型和2例無法分類型；33例（58.9%）見淀粉樣物廣泛沉積于腎小球內、腎小管基底膜、間質或血管壁，包括19例ALλ型、5例ALκ型、3例AA型及6例無法分類型（圖3，表1）。

病理分型與免疫球蛋白、補體及纖維蛋白原的沉積免疫球蛋白及補體在各型腎淀粉樣變性腎小球內均有不同程度的沉積，其中33例（58.9%）伴IgM沉積，19例（33.9%）伴C3沉積，16例（28.6%）分別伴IgA、C1q沉積。在43例AL型中，IgM、IgA、C3沉積率分別達62.8%、34.9%、30.2%。在3例AA型、10例無法分類型中，IgG、C3沉積率分別達66.7%、40%。

病理分型與臨床表現(xiàn)患者表現(xiàn)為不同程度的蛋白尿，24 h尿蛋白定量1.48～11.5 g，其中AL型（5.08±2.40）g，AA型（4.32±1.32）g，無法分類型（4.77±2.02）g；42例（75.0%）診斷為腎病綜合征。根據(jù)腎小球剛果紅染色結果，將43例AL型分為輕度沉積組（1+～2+，18例）和重度沉積組（3+～4+，25例），輕度沉積組24 h尿蛋白定量為（3.45±1.64）g，重度沉積組為（5.75±2.80）g，兩組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。此外，10例（17.9%，包括9例AL型、1例無法分類型）伴鏡下或肉眼血尿；8例（14.3%，均為AL型）伴腎功能不全；13例（23.2%，均為AL型）血或尿液檢查發(fā)現(xiàn)異常升高的單克隆性蛋白；10例（17.9%，均為AL型）經(jīng)活檢證實胃腸道淀粉樣變；7例（12.5%，包括6例AL型、1例無法分類型）影像學檢查高度懷疑存在心臟淀粉樣物沉積。

多數(shù)患者存在腎外器官病變。43例AL型患者中29例（67.4%）存在腎外病變，包括12例（27.9%）血液系統(tǒng)疾病，其中8例多發(fā)性骨髓瘤，2例漿細胞增生性疾病，1例慢性淋巴細胞性白血病，1例血小板增多癥；其余病變包括1例（2.3%）伴甲狀腺功能低下，2例（4.7%）伴限制性心肌病，1例（2.3%）伴慢性支氣管炎，1例（2.3%）伴肺癌手術史，1例（2.3%）伴類風濕性關節(jié)炎，3例（7.0%）伴慢性乙型肝炎，3例（7.0%）伴糖尿病病史，5例（11.6%）伴高血壓。3例AA型患者中，1例伴有糖尿病、高血壓，2例伴有慢性血吸蟲性肝病。10例無法分類型中，1例伴肥厚性心肌病，4例伴高血壓，2例伴糖尿病，1例伴類風濕性關節(jié)炎，1例伴潰瘍性結腸炎。

討 論

我國腎淀粉樣變性的發(fā)病率呈逐年上升趨勢［5］。復旦大學基礎醫(yī)學院病理學系郭慕依對2006年以前近8 000例腎活檢資料行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，腎淀粉樣變性檢出率為0.58%［7］；本研究進一步分析該系近10年資料，發(fā)現(xiàn)其檢出率上升至1.6%。國外學者報道腎活檢病例中腎淀粉樣變性檢出率為1.0%～1.5%，患者平均年齡多為60～70歲［8-9］。Jin等［10］對我國65歲以上腎病患者進行研究發(fā)現(xiàn)，5.99%確診為腎淀粉樣變性，占繼發(fā)性腎小球疾病的16.88%。本研究對10年間確診的56例腎淀粉變臨床資料進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，患者平均年齡為58.6歲，男性略多于女性；75.0%表現(xiàn)為典型的腎病綜合征；由于老年人的病理生理學特點，較多患者存在腎外病變，包括心血管系統(tǒng)疾病、糖尿病、腫瘤等，且17.9%存在2個或以上器官的淀粉樣物質沉積，故臨床表現(xiàn)較為復雜且缺乏特異性。因此，臨床對腎淀粉樣變性可能存在一定的漏診或誤診，應及時行腎活檢病理檢查。最近我國腎臟疾病臨床研究中心發(fā)布《系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性診斷和治療指南》，對臨床表現(xiàn)為腎病綜合征、體位性低血壓、腎體積增大、左心室肥厚且伴不明原因N端腦鈉肽前體（N-terminal B-type natriuretic peptide，NTproBNP）升高等的中老年患者，應注意淀粉樣變性的可能［11］。

前體蛋白在發(fā)生構象改變形成β折疊的過程中，獲得一致的形態(tài)學特點，包括對剛果紅染料的親和性，在偏振光顯微鏡下呈綠色雙折射光性，以及電鏡下纖細的纖維絲狀結構，因此通過結合上述檢查手段可顯著提高淀粉樣變性的確診率［3，6］。本研究中有4例光鏡檢查呈腎小球病變輕微、剛果紅染色呈陰性或可疑者，在電鏡檢查時發(fā)現(xiàn)少量淀粉樣原纖維沉積，但由于沉積物較少，偏振光檢查呈陰性結果。因此，雖然剛果紅染色及偏振光顯微鏡檢查仍是確診淀粉樣變性的金標準［2，6］，但在疾病早期當?shù)矸蹣游锍练e較少或切片過薄時可出現(xiàn)假陰性結果，因此電鏡檢查對確診早期腎淀粉樣變性有極大價值［12-13］。此外，當腎小球淀粉樣物沉積形成結節(jié)樣改變時，應注意與其他形成結節(jié)性病變的腎小球疾病進行鑒別診斷，例如糖尿病腎病、膜增生性腎炎、輕鏈腎病、致密沉積物病等，根據(jù)病理學特征及臨床表現(xiàn)其鑒別診斷并不困難。

雖然不同類型淀粉樣前體蛋白具有不同的發(fā)病機制及發(fā)生率，但由于臨床表現(xiàn)缺乏特異性且治療方案主要針對所沉積的特異性淀粉樣蛋白，因此必須明確腎淀粉樣變性的病理類型［1，6，10，14］。常規(guī)檢測方法是采用免疫組化或免疫熒光染色法確定淀粉樣蛋白類型包括輕鏈κ、λ及AA等。淀粉樣變性最常見病理類型為AL型，其前體蛋白為輕鏈κ或λ（light chain，L），臨床常有多發(fā)性骨髓瘤或漿細胞增生性疾?。?-2］。本研究經(jīng)免疫染色發(fā)現(xiàn)，56例腎淀粉樣變性病例中43例為AL型（76.8%），占已明確病理分型的93.5%（43/46），其中36例僅λ陽性，提示ALλ型是本組腎淀粉樣變性的主要類型。13例（23.2%）在腎活檢時血液或尿液檢查發(fā)現(xiàn)異常升高的單克隆性免疫球蛋白，12例（占AL型患者27.9%）伴有血液系統(tǒng)疾病，包括多發(fā)性骨髓瘤、漿細胞增生性疾病等，上述檢出比例較國內學者報道偏低［12，15］，可能是由于部分病例在腎活檢時臨床未及時確診，或者伴有單克隆性免疫球蛋白血癥患者尚未出現(xiàn)相應的臨床癥狀或體征。第二大類病理類型為AA型，其前體蛋白為血清淀粉樣蛋白A（serum amyloid A protein，SAA），臨床常繼發(fā)于慢性感染或炎癥疾?。?］，與炎癥時肝臟合成SAA增多導致其發(fā)生異常構型改變并沉積于器官組織內相關。本研究3例AA型中2例臨床伴慢性血吸蟲性肝病，可能與肝臟損傷造成SAA蛋白代謝異常相關。AA型腎淀粉樣變性構成比在各國報道大有不同，德國腎淀粉樣變性病例中40.3%為AA型［8］，法國AA型構成比為39.1%［16］，日本AA型構成比為41.7%［17］。本研究結果顯示AA型僅占腎淀粉樣變性的5.4%，占已明確病理分型的6.5%（3/46），與其他國內學者報道極為接近［12，15］。

本研究中淀粉樣物在腎小球內及球外有較廣泛沉積，所有病例均顯示腎小球內沉積，23例（41.1%）淀粉樣物僅沉積于腎小球和/或血管壁，33例（58.9%，包括24例AL型及3例AA型）均顯示淀粉樣物在腎小球、腎小管基底膜、間質、血管壁等處廣泛沉積。Nishi等［8］通過剛果紅染色及偏光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，AL型淀粉樣物更常沉積于腎小球毛細血管袢基膜形成觸須樣改變；而AA型病例中淀粉樣物則更常出現(xiàn)于腎小管基底膜及間質中。本研究中雖AA型病例數(shù)少，但均顯示淀粉樣物在腎小球內及球外廣泛沉積，且腎小球內淀粉樣物重度沉積病例的尿蛋白定量顯著高于輕度沉積者，與Li等［12］研究結果相似。

腎小球內淀粉樣物沉積常同時伴有免疫球蛋白和補體的沉積。Nishi等［8］報道在AL型和AA型腎淀粉樣變性中，IgG和C3的陽性率分別達60%和45%；50%～60%的AA型伴有腎小球內IgA、IgM和C3的沉積，較AL型更為常見，可能與多數(shù)AA型患者伴有類風濕性關節(jié)炎相關。本研究中幾乎所有病例均存在腎小球內免疫球蛋白和補體免疫熒光染色陽性，尤以ALλ型更常見，其中IgM陽性率達60%，其次為C3、IgA和IgG，陽性率分別為33.9%、28.6%和12.5%；然而，電鏡檢查顯示98.2%的病例未發(fā)現(xiàn)腎小球內典型的電子致密物沉積，提示免疫球蛋白及補體在腎淀粉樣變性腎小球內的沉積以 非 特 異 性 沉 積可能性 大［2，9，17］。但是 由 于 電鏡觀察范圍較為局限，在免疫球蛋白沉積較少時可能不易被發(fā)現(xiàn)，故可能造成腎淀粉樣變性合并其他類型腎病的漏診，如合并我國最常見腎病類型——IgA腎病。

本研究中10例石蠟組織經(jīng)免疫組化染色結果為陰性，導致其病理分型困難，原因可能包括：（1）石蠟包埋過程中抗原決定簇被屏蔽；（2）前體蛋白包括輕鏈、重鏈等存在斷裂，不能被抗體識別；（3）目前市售商品化抗體均以未形成異常構型之前的天然蛋白作為抗原進行制備，抗體敏感性及特異性有限，以致無法成功識別相應的淀粉樣蛋白［2-3，14］；（4）可能存在檢測范圍之外的病理類型，例如遺傳性淀粉樣變性。遺傳性淀粉樣變性與前體蛋白的編碼基因突變相關，常見者包括纖維蛋白原（fibrinogen，AFib）、載脂蛋白AI/AII（apolipoprotein AI/AII，Apo AI/AII）、轉甲狀腺素蛋白（transthyretin，TTR）等。英國學者對350例確診為AL型腎淀粉樣變性且無腎病家族史者行研究發(fā)現(xiàn)，34例（9.7%）存在前體蛋白基因突變，包括18例AFib基因突 變、13例TTR基因突變［18］。有關我國遺傳性腎淀粉樣變性的研究僅見少數(shù)個案報道且多為AFib［19-20］。本研究中3例ALλ型及1例無法分類型伴纖維蛋白原沉積，行基因檢測分析均未見突變位點，故除外AFib可能。由于遺傳性淀粉樣變并非罕見且散發(fā)病例患者無家族史，因而容易造成臨床醫(yī)師忽視。此外，由于中老年人可能存在基因突變，對遺傳性淀粉樣變的確診不能僅僅依賴于DNA分析，應經(jīng)免疫染色、蛋白質組學或質譜分析確定淀粉樣蛋白類型［2-3，6］。因此在常規(guī)病理診斷工作中，應及時應用冰凍組織進行免疫熒光染色［2，10］，必要時進行氨基酸測序或基因分析。在本研究中我們試圖對10例無法分類型進行質譜分析但未能成功，主要原因包括：（1）腎活檢組織量少，部分病例在反復切片用于免疫染色后所剩組織極為有限；（2）4%甲醛水溶液致蛋白交聯(lián)，改變肽段理化性質，增加了蛋白裂解、酶切難度，需多次預實驗以獲得最佳工作條件；（3）酶切需去除SDS等不兼容質譜的小分子物質，進一步造成微量樣本的損耗；（4）胰蛋白酶的酶切不充分，非酶消化肽段多。

本研究的局限性在于：回顧性研究；時間跨度較大；由于部分臨床資料缺失，未能分析腎淀粉樣變性的腎臟病理改變與血壓、血清生化、腎臟影像學等檢查結果的相關性，亦未行隨訪。

綜上所述，ALλ型是本組腎淀粉樣變性最常見病理類型；結合剛果紅染色、電鏡檢查及偏光顯微鏡檢查可顯著提高腎淀粉樣變性的確診率；免疫染色對確定其病理分型尤為重要，基因分析有助于鑒別是否存在遺傳性淀粉樣變性；對臨床表現(xiàn)為腎病綜合征的中老年人及時行腎活檢穿刺有助于該病的早期診斷及治療。

作者貢獻聲明覃喬靜數(shù)據(jù)采集，數(shù)據(jù)分析和論文撰寫。常凱利數(shù)據(jù)統(tǒng)計，免疫染色，論文修訂。趙仲華病理技術支持。劉學光論文構思，撰寫和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。