魏 智（綜述） 趙洪波張 濤馮 璇杜 琰△（審校）

（1復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院臨床流行病學(xué)研究室 上海200011；2香港中文大學(xué)醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科系 香港999077）

人載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽3（apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide 3，APOBEC3）家族的胞苷脫氨酶通過編輯病毒基因組，在病毒感染的先天免疫應(yīng)答中起著重要作用［1］。然而，APOBEC3（A3）酶的胞苷脫氨酶活性也會(huì)誘導(dǎo)宿主基因組中的體細(xì)胞突變，這可能會(huì)促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展。人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是宮頸癌的主要病因，但具體作用機(jī)制仍有待研究。近期研究發(fā)現(xiàn)A3家族可能作為HPV感染至宮頸癌過程中的重要橋梁。本文從A3對(duì)HPV及人體內(nèi)抑癌基因的影響等方面討論目前A3與HPV清除、突變以及宮頸癌發(fā)生的研究進(jìn)展。

HPV與宮頸癌宮頸癌是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤之一，是全球女性中第四常見的癌癥。全球腫瘤流行病學(xué)研究報(bào)道，每年約有570 000例新診斷的宮頸癌病例，其中約311 000例因?qū)m頸癌導(dǎo)致死亡［2］。

大量流行病學(xué)及分子生物學(xué)證據(jù)表明，HPV感染與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)［3］，尤其是以HPV16及HPV18為主的高危型HPV（high risk human papilloma virus，HR-HPV）［4-5］。HPV致癌機(jī)制是病毒整合至宿主基因組。在HPV基因組編碼的8種蛋白質(zhì)中，非結(jié)構(gòu)蛋白E6和E7與HR-HPV的致癌作用有關(guān)。E6和E7蛋白通過干擾有絲分裂過程中的著絲粒復(fù)制，直接增加基因組的不穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致染色體重排和拷貝數(shù)的變化［6-8］，以及通過降解人體內(nèi)的p53和Rb抑癌蛋白導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生［9-11］。同時(shí)有研究顯示，HR-HPV持續(xù)感染是誘發(fā)正常宮頸從癌前病變，即宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）逐步從不同級(jí)別（CIN 1級(jí)：輕度非典型增生，CIN 2級(jí)：中重度非典型增生，CIN 3級(jí)：重度非典型增生及原位癌）發(fā)展至宮頸癌的關(guān)鍵因素［12］。

APOBEC3A3蛋白是一種胞嘧啶核苷酸脫氨酶，其基因定位于22號(hào)染色體。目前已發(fā)現(xiàn)的A3家族成員有A3A～A3H等7個(gè)亞型。A3蛋白是一種重要的免疫分子，很早就有研究發(fā)現(xiàn)A3與自身免疫相關(guān)［13］。A3G是最早被發(fā)現(xiàn)具有抗病毒活性的亞型。在宮頸細(xì)胞中A3常被干擾素（interferon，IFN）刺激上調(diào)，構(gòu)成清除外來DNA的重要防御機(jī)制。A3蛋白亞型都有1或2個(gè)胞嘧啶脫氨酶結(jié)構(gòu)域（cytidine deaminase domains，CD），其一般為His-XGlu-X23-28-Pro-Cys-X2-4-Cys（其中X為任一氨基酸），A3家族抗病毒的胞嘧啶核苷酸脫氨酶活性主要是由CD結(jié)構(gòu)催化完成［13］。CD可以通過作用于單鏈DNA上的胞嘧啶核苷，使其脫氨基生成尿嘧啶核苷，生成的尿嘧啶核苷進(jìn)而被尿嘧啶DNA糖基化酶（uracil DNA glycosylase，UDG）從單鏈和雙鏈DNA中 切 除［14］。脫 嘧 啶 內(nèi) 切 核 酸 酶（apurinic apyrimidinic endonuclease，APE）進(jìn)一步促進(jìn)這種缺失尿嘧啶的DNA降解與清除［15］，至此完成A3蛋白對(duì)外源DNA的清除過程。然而，如果單鏈DNA未被UDG和APE處理，僅經(jīng)A3處理使DNA中胞嘧啶核苷脫氨基為尿嘧啶核苷后繼續(xù)被轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，轉(zhuǎn)錄或復(fù)制出來的DNA鏈中本身胞嘧啶核苷對(duì)應(yīng)的鳥嘌呤核苷變成腺嘌呤核苷，最終致使形成C→T突變，這可能是DNA或RNA產(chǎn) 生A3特 征 性 突變的重要機(jī)制。

有證據(jù)表明A3蛋白除抵御病毒感染，在先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用外，在復(fù)制細(xì)胞中表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致DNA斷 裂［16］?？?速 復(fù) 制 細(xì)胞更 易 受 到A3誘導(dǎo)的DNA損傷，支持了A3蛋白導(dǎo)致人類腫瘤基因組不穩(wěn)定的假設(shè)［16］。對(duì)癌癥基因表達(dá)數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，A3B與多個(gè)DNA損傷反應(yīng)和G2/M期細(xì)胞周期基因共表達(dá)，表明A3B很可能是在G2/M這一活躍復(fù)制期引發(fā)DNA損傷，并提示A3B可能和細(xì)胞DNA的損傷甚至癌癥的發(fā)生有密切關(guān)系［17］。

APOBEC3與HPV研 究 發(fā) 現(xiàn)HPV的DNA中可能存在上述A3特征性突變，在良性疾病及宮頸癌前病變中，A3A、A3C和A3H可能是誘導(dǎo)HPV突變感染的重要亞型［18］。隨后對(duì)宮頸角質(zhì)化細(xì)胞W12（該細(xì)胞攜帶游離狀態(tài)的HPV病毒）的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，用IFN誘導(dǎo)內(nèi)源性A3A、A3F以及A3G過表達(dá)，可導(dǎo)致HPV環(huán)狀DNA發(fā)生突變［18］。宮頸癌和其他HPV相關(guān)腫瘤癌細(xì)胞中均表現(xiàn)出A3突變特征［19-21］，有研究表明，A3A和A3B是僅有的兩個(gè)在HPV陽性角質(zhì)形成細(xì)胞和癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的亞型［22-23］，也有研究發(fā)現(xiàn)A3G與HPV以及宮頸癌的發(fā)展密切相關(guān)［24］。

APOBEC3促進(jìn)HPV的DNA突變有研究通過PCR從CIN和侵襲性宮頸癌（invasive cervical cancer，ICC）患者的宮頸脫落細(xì)胞DNA中擴(kuò)增出16型、52型和58型HPV的DNA，并進(jìn)行全基因組測 序［25］。總共從151個(gè)樣 本中檢測到1 052個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)主要突變?yōu)镃→T和C→A。在CIN中主要檢測到C→T突變，但在CIN-2/3級(jí)中這種突變較CIN-1級(jí)的發(fā)生率降低；而在ICC中主要為C→A突變［25］。對(duì)其核苷酸序列分析表明，TpCpN是APOBEC的首選靶序列，也是HPV基因組中C→T取代的主要位點(diǎn)［25］。對(duì)宮頸角質(zhì)化W12細(xì)胞進(jìn)行干擾素IFN-β誘導(dǎo)的A3高表達(dá)處理后，使用3D-PCR檢測發(fā)現(xiàn)A3G可引起HPV16-E2基因的高突變，該突變可能是HPV基因組進(jìn)化，甚至宮頸癌變的可能原因之一［18］。

目前研究認(rèn)為人群中流行的HPV16分離株存在高度的遺傳多樣性［26-27］。研究顯示，觀察期間未進(jìn)展為癌前期或癌癥的HPV感染者中致癌蛋白E7罕見突變的發(fā)生率更高，這一發(fā)現(xiàn)表明E7在癌前病變或癌癥中更加穩(wěn)定，不易發(fā)生變異，這可能意味著E7的突變可能會(huì)降低HPV16的致癌性［26］。最近的一項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)了更多的病毒遺傳多樣性，而且其由A3驅(qū)動(dòng)的可能性更大，隊(duì)列研究表明這與良性感染或其隨后的病毒清除有關(guān)，A3亞型誘導(dǎo)的這一突變可能限制了HPV16的活性，進(jìn)而限制了HPV16的致癌潛力［28］。因此推測，A3蛋白誘導(dǎo)的這一突變看似有助于促進(jìn)HPV16譜系的進(jìn)化，但其實(shí)更多的是限制其致癌能力，即起到免疫防御作用。

以上結(jié)果提示：A3蛋白是HPV基因組突變的驅(qū)動(dòng)因素，特別是在CIN-1級(jí)病變中，較高的HPV病毒復(fù)制水平可能使其基因組更容易受到APOBEC的攻擊；HPV基因組在宿主內(nèi)變異是HPV遺傳多樣性的來源，主要是由宿主細(xì)胞A3編輯產(chǎn)生。A3除聯(lián)合UDG、APE清除人體細(xì)胞感染的HPV DNA外，誘導(dǎo)HPV的SNP變異也可以限制病毒活性，從而降低其致癌能力，起到免疫防御作用。

HPV促進(jìn)細(xì)胞中APOBEC3的表達(dá)及活性有研究致力于不同A3亞型（尤其是A3A與A3B）表達(dá)上調(diào)與HPV感染、癌前病變和宮頸癌的相關(guān)性［22］。HPV基因組中常見的C→T突變主要由A3介導(dǎo)，而HPV的DNA復(fù)制過程中暴露的單鏈DNA（single-stranded DNA，ssDNA）是A3的 主 要 目標(biāo)［20，29-30］。由 此 推 測，HPV的DNA復(fù) 制 為APOBEC介導(dǎo)的HPV病毒基因組突變提供了條件。

目前已證明，在HPV陽性的角質(zhì)形成細(xì)胞和宮頸癌組織中，A3A和A3B的mRNA表達(dá)通過HPV致癌蛋白E7相關(guān)的機(jī)制上調(diào)，還有研究表明HPV致癌蛋白E6增加了A3B mRNA的表達(dá)［22-23，31-32］。其可能機(jī)制與p53基因相關(guān)，一些實(shí)驗(yàn)提示p53蛋白的失活導(dǎo)致A3B表達(dá)上調(diào)［32-34］：p53突變后癌細(xì)胞中A3B的 表 達(dá) 上 調(diào)，但 與A3B相 反，野生 型p53可上調(diào)A3A的表達(dá)［34］；HPV致癌蛋白E6介導(dǎo)的A3B表達(dá)上調(diào)的可能機(jī)制是由于其解除了p53對(duì)A3B的表達(dá)抑制［32］。由于p53對(duì)不同A3亞型表達(dá)的調(diào)控可能在細(xì)胞應(yīng)激條件下影響病毒感染的過程，了解p53和A3亞型之間的相互作用或許可以為治療持續(xù)性病毒感染和腫瘤病變提供新的途徑。除通過p53，HPV還可能通過其他途徑，如cullin 2依賴蛋白、轉(zhuǎn)錄因子TEAD等，影響A3蛋白的表達(dá)，甚至其穩(wěn)定性［35-36］。

綜上所述，我們認(rèn)為HPV致癌蛋白E6/E7上調(diào)內(nèi)源性A3蛋白表達(dá)水平，為研究HPV陽性癌細(xì)胞中A3特征性突變?cè)龆嗵峁┝诵碌姆较颉?/p>

APOBEC3與腫瘤理論上，大多數(shù)DNA病毒及其宿主的雙鏈基因組應(yīng)受到保護(hù)，不受A3介導(dǎo)的胞苷脫氨作用影響。然而，在雙鏈DNA基因組中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)A3誘導(dǎo)的突變。這些A3A和A3B介導(dǎo)的突變主要是由DNA復(fù)制過程中滯后鏈模板的脫氨引起的［20］。以上結(jié)果說明，癌細(xì)胞由于其高水平的細(xì)胞增殖和復(fù)制壓力，是A3A和A3B介導(dǎo)的胞苷脫氨的主要靶點(diǎn)。

研究發(fā)現(xiàn)，A3A有細(xì)胞核內(nèi)編輯HPV DNA的功能，在機(jī)體對(duì)抗和清除HPV的過程中可能起著重要作用，由此推測A3A可能參與抑制HPV相關(guān)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［37］。但也有研究顯示一些腫瘤，如肝細(xì)胞癌、乳腺癌、骨肉瘤、淋巴瘤等中A3特征性突變?cè)黾?，且A3A可能破壞自身細(xì)胞DNA，說明A3可能與腫瘤發(fā)生也密切相關(guān)［16，38-39］。

通過對(duì)19種癌癥的100萬種突變進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)A3B特征性突變與膀胱癌、宮頸癌、肺鱗癌、肺腺癌、頭頸癌、乳腺癌等至少6種癌癥密切相關(guān)［21］?，F(xiàn)階段已發(fā)現(xiàn)在HPV陽性腫瘤中，A3B過表達(dá)及其引起的DNA特征性突變?cè)龆啵?9-21，40］。通過檢測細(xì)胞DNA損傷反應(yīng)（DNA damage response，DDR）通路中經(jīng)典蛋白激酶的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)A3（尤其是A3A）過表達(dá)可以激活HPV感染細(xì)胞中的DDR通路，從而破壞細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性，提示A3A在HPV誘導(dǎo)的腫瘤形成中起重要作用［41］。這些研究表明A3可能成為HPV相關(guān)腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

APOBEC3與宮頸癌有研究報(bào)道轉(zhuǎn)染A3G的宮頸癌SiHα細(xì)胞中HPV E6 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低、抑癌基因p53mRNA和蛋白表達(dá)水平則顯著升高，從而推測A3不僅可以通過清除DNA來抵御HPV感染，還可以通過降低HPV E6和上調(diào)p53基因來抑制HPV的致癌作用。另外，在宮頸癌患者A3G基因外顯子3上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)（rs5757465），此基因罕見類型（CC型）的比例較高，提示其可能是宮頸病變和宮頸癌的危險(xiǎn)因素［42］。

Iizuka等［24］對(duì)1～3級(jí)CIN及鱗狀細(xì)胞癌患者的宮頸活檢組織免疫熒光染色，在CIN及鱗癌病變中均檢出免疫反應(yīng)性A3G蛋白，其表達(dá)強(qiáng)度和陽性面積增加一致，且在CIN-3級(jí)病變細(xì)胞中明顯高于CIN-1/2級(jí)病變細(xì)胞。對(duì)維吾爾族婦女宮頸癌、CIN及正常對(duì)照組織的研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中A3G mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著高于CIN組，CIN組又明顯高于正常對(duì)照組［42］。提示A3G與癌癥進(jìn)展存在一定的相關(guān)性，其在HPV誘導(dǎo)宮頸癌發(fā)生的過程中可能起到重要作用。

APOBEC突變負(fù)荷與宮頸癌的突變總數(shù)顯著相關(guān)性［43］。對(duì)69例宮頸癌樣本進(jìn)行外顯子組測序，發(fā)現(xiàn)這些樣本的APOBEC突變模式豐富，主要為TCW和WGA突 變［44］。在HPV感 染 樣 本 中 發(fā) 現(xiàn)A3B mRNA在高轉(zhuǎn)錄水平；與腺癌相比，APOBEC特征突變?cè)诰哂绪[狀和腺鱗狀組織學(xué)特征的宮頸腫瘤中更為常見［44］。

轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在宮頸癌進(jìn)展過程中具有促腫瘤作用［45］。研究提示經(jīng)典的NF-κB途徑在不同類型癌細(xì)胞的A3B調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程中起重要作用［46］。另有研究發(fā)現(xiàn)NF-κB活化還可誘導(dǎo)APOBEC蛋白的表達(dá)［47］，表明A3是NF-κB通路與宮頸癌的突變特性之間一個(gè)重要的聯(lián)系紐帶。

研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染A3A質(zhì)粒的宮頸癌Hela細(xì)胞遷移數(shù)量明顯低于空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組，而后兩者之間Hela細(xì)胞遷移能力無明顯差異，提示A3A基因?qū)m頸癌Hela細(xì)胞遷移能力可能具有一定的抑制作用［48］。也有研究發(fā)現(xiàn)在用A3G轉(zhuǎn)染宮頸癌Hela細(xì)胞后，A3G過表達(dá)抑制了子宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲［49］。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果間接提示A3在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展以及浸潤轉(zhuǎn)移過程中可能起著重要作用，A3有可能通過抑制宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移而成為宮頸癌治療的新靶點(diǎn)。

研究發(fā)現(xiàn)A3B的上調(diào)與癌細(xì)胞中異質(zhì)核糖核蛋白A3（hnRNPA3）水平的增加有關(guān)，hnRNPA3通過與單鏈端粒（TTAGGG）重復(fù)序列結(jié)合并募集端粒酶以延長端粒從而調(diào)節(jié)端粒長度，而端粒長度是癌癥的一個(gè)標(biāo)志［50］。hnRNPA3還可能與A3B結(jié)合并將其募集到基因組DNA中，導(dǎo)致基因組DNA由于A3B脫氨酶活性而發(fā)生突變。這兩種機(jī)制都可以解釋A3B與癌癥的關(guān)聯(lián)。此外，免疫熒光分析表明A3B和hnRNPA3是 共 定 位 的［50］。該 研 究 提 示hnRNPA3是一種與A3B相互作用的重要細(xì)胞蛋白，可能為潛在的抗癌靶點(diǎn)。

結(jié)語本文重點(diǎn)討論目前A3的若干亞型與HPV清除、突變以及宮頸癌發(fā)生的研究進(jìn)展。HPV感染宮頸細(xì)胞后，其DNA被A3編輯并清除，從而起到免疫防御的作用。僅被A3編輯而未被成功清除的DNA產(chǎn)生A3特征性突變，其基因組不穩(wěn)定性增加。HR-HPV致癌蛋白E6和E7在A3的上調(diào)中起著很重要的作用，抑癌基因p53是其重要橋梁，其復(fù)制過程中產(chǎn)生的單鏈也對(duì)A3發(fā)揮作用提供了條件；而HPV基因組受APOBEC編輯產(chǎn)生的宿主內(nèi)變異是HPV遺傳多樣性的進(jìn)化來源。A3表達(dá)水平與宮頸癌細(xì)胞中DNA總突變負(fù)荷之間存在顯著正相關(guān)；在宮頸癌中A3過表達(dá)及其引起的DNA特征性突變?cè)龆?。一些研究表明，A3能抑制宮頸癌細(xì)胞遷移能力、促進(jìn)hnRNPA3表達(dá)以延長端粒，在CIN與ICC中表達(dá)的強(qiáng)度差異都提示APOBEC蛋白在HPV誘導(dǎo)的宮頸癌發(fā)生過程中可能起到重要作用。

作者貢獻(xiàn)聲明魏智資料收集，論文撰寫。趙洪波論文構(gòu)思和修訂。張濤，馮璇論文修訂。杜琰論文構(gòu)思、撰寫和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。