楊慧麗，楊俊娟，李新敏

作者單位：鄭州市婦幼保健院，a婦產(chǎn)科，b病理科，河南 鄭州450053

子癇前期（preeclampsia，PE）是妊娠期常見并發(fā)癥，好發(fā)于妊娠20周以后，多表現(xiàn)為血壓升高和尿蛋白等癥狀，但其病因尚不明確，臨床治療僅限于對癥治療、盡量延長孕周，尚無特效療法，我國孕婦發(fā)病率達(dá)5%～10%，是引起孕產(chǎn)婦和圍生兒死亡的主要原因。目前普遍認(rèn)為，PE與滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤過淺導(dǎo)致胎盤淺著床有關(guān)，滋養(yǎng)細(xì)胞對母體子宮內(nèi)膜的適當(dāng)浸潤對維持正常妊娠非常重要，但其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，可通過與靶mRNA 3ˊ非編碼區(qū)（3ˊ-untranslated region，3ˊUTR）完全或不完全互補(bǔ)結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄后表達(dá)，與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生物學(xué)活性有關(guān)，最新研究表明，miRNA 與PE 發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，有望成為其新型診斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。miR-21是一種癌基因，與多種腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移等有關(guān)，與PE的關(guān)系及對滋養(yǎng)細(xì)胞的影響少有研究。滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤母體子宮內(nèi)膜機(jī)制與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移很相似，因此本研究擬探究miR-21 表達(dá)與PE的關(guān)系及對人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲、凋亡的影響，并初步探究其可能調(diào)控機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年8月至2019年10月鄭州市婦幼保健院收治的45 例PE 病人（PE 組）及45 例匹配正常孕婦（正常組）剖宮產(chǎn)手術(shù)中獲得的胎盤組織。PE 病人年齡范圍22～35 歲，年齡（28.02±3.15）歲，孕周（34.26±2.49）周，其中輕度PE 31 例、中度PE 12 例和重度PE 2 例。正常組孕婦年齡范圍21～35 歲，年齡（26.92±3.47）歲，孕周（35.13±3.11）周，兩組孕婦年齡、孕周等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=1.575、1.465，

P

=0.119、0.147），具有可比性。本研究經(jīng)鄭州市婦幼保健院倫理委員會批準(zhǔn)通過（審批文號2016-〔S〕08），所有樣品采集及資料調(diào)查均取得病人及其家屬知情同意并簽署知情同意書，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》。

1.2 細(xì)胞、試劑及儀器

人絨毛膜外滋養(yǎng)層細(xì)胞（HTR-8/SVneo）細(xì)胞（上?？道噬锟萍加邢薰?，貨號kl-CC337655）；RPM 11640 培養(yǎng)基（美國Gibco公司，貨號21870084）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，美國Gibco 公司，貨號10099141）；AnnexinVFITC 凋亡檢測試劑盒（美國Sigma 公司，貨號APOAF）；含miR-21種子序列的PTEN 3ˊUTR 野生型重組質(zhì)粒（pmirGLO-PTEN-Wt）及突變型重組質(zhì)粒（pmirGLO-PTEN-Mut）由廣州銳博生物科技公司合成；Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑盒（貨號11668）、miRNA 提取試劑盒（貨號：AM1561）購自美國Invitrogen 公司；microRNA 定量試劑盒（貨號638315）、TB GreenPremix Ex Taq?Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（貨號RR820A）購自TaKaRa 公司；一抗兔源anti-PTEN抗體（貨號ab32199）、anti-p-PI3K（貨號ab32089）、anti-p-AKT（貨號ab38449）、anti-GAPDH 抗體（貨號ab9485）、羊抗兔anti-IgG（貨號ab205718）均購自英國Abcam 公司；引物、miR-21 模擬物（mimics）、抑制物（inhibitor）及無意義序列（scramble）由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒（貨號E1920）購自美國Promega公司等。

Evolution 220 紫外分光光度計(jì)、FC 型酶標(biāo)儀、Forma Steri-Cycle i160 5%二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher 公司；倒置熒光顯微鏡ix53 購自日本Olympus 公司；羅氏LightCycler96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購自Roche 公司；CytoFLEX 流式細(xì)胞儀購自美國Beckman Coulter公司等。

1.3 方法

1.3.1

細(xì)胞培養(yǎng)及分組 HTR-8/SVneo 細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后采用含5%FBS、1%青鏈霉素的RPM 11640 培養(yǎng)基置于37 ℃、飽和濕度、5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞傳代時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化。

1.3.2

細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)期生長HTR-8/SVneo 細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)后以5×10個(gè)/孔接種于6 孔細(xì)胞板，轉(zhuǎn)染前1 d 更換為不含青鏈霉素的培養(yǎng)基孵育，采用脂質(zhì)體2000 轉(zhuǎn)染法將miR-21 mimics（mimics 組）、miR-21 inhibitor（inhibitor 組）及scramble（NC 組）序列分別轉(zhuǎn)染至HTR-8/SVneo 細(xì)胞，另設(shè)無任何處理HTR-8/SVneo 細(xì)胞為空白對照組（BC 組），每組6 個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染后4～6 h 更換新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h 后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3

RT-qPCR miRNA 提取試劑盒提取PE 病人及正常胎盤組織、各組HTR-8/SVneo 細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測其濃度及純度，反轉(zhuǎn)錄的cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。?shí)時(shí)定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）法擴(kuò)增miR-21、PTEN mRNA 表達(dá)。miR-21 正向引物序列（5’→3’）為GTGCAGGGTCCGAGGT，反向引物序列（5’→3’）為GCCGCTAGCTTATCGACTACG。內(nèi)參U6 正向引物序列（5’→3’）為CTCGCTTCGGCAGCACA，反向引物序列（5’→3’）為AACGCTTCACGAATTTGCGT。PTEN 正向引物序列（5’→3’）為CCGAAAGGTTTTGCTACCATTCT，反向引物序列（5’→3’）為AAAATTATTTCCTTTCTGAGCATTCC 。內(nèi) 參GAPDH 正 向引 物 序 列（5’→3’）為AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，反向引物序列（5’→3’）為AGGGGCCATCCACAGTCTTC。反應(yīng)條件：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，34 s，40 個(gè)循環(huán)。2法分析miR-21 及PTEN mRNA相對表達(dá)水平。

1.3.4

WB 實(shí)驗(yàn) 參照蛋白提取試劑盒操作說明提取PE 病人及正常胎盤組織、1.3.2 中四組細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度后，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ?0μg 蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉，添加一抗（PTEN 1∶1 000；p-PI3K 1∶500；p-Akt 1∶1 000；GAPDH 抗體1∶500）4 ℃孵育過夜，TBST 緩沖液洗膜，添加二抗IgG（1∶5 000）室溫孵育1 h，按上述方法洗膜，之后依次顯色，曝片，以GAPDH為內(nèi)參，觀察并分析蛋白條帶灰度值。

1.3.5 Tanswell

侵襲實(shí)驗(yàn) 將對數(shù)期生長細(xì)胞鋪板Tanswell小室，轉(zhuǎn)染及分組同1.3.2，轉(zhuǎn)染4 h后消化重懸細(xì)胞，以1×10/小室接再次種于上述Tanswell小室，添加培養(yǎng)基100 μL，24 h后乙醇固定、結(jié)晶紫染色，清洗，拍照，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)求其平均值。

1.3.6

細(xì)胞凋亡檢測 將1.3.2 中四組細(xì)胞制成1×10/mL 單細(xì)胞懸液，參照AnnexinV-FITC 凋亡檢測試劑盒說明書，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.3.7

雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 采用TargetScan 7.1（http：//www. targetscan. org/vert_71/）軟 件 及miRTarBase軟件（http：//mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）預(yù)測人miR-21 的潛在靶基因及靶向結(jié)合種子序列位點(diǎn)。采用脂質(zhì)體2000 轉(zhuǎn)染法將miR-21 mimics+ pmirGLO-PTEN-Wt （mimics+Wt組）、scramble+ pmirGLO-PTEN-Wt（NC+ Wt 組）、miR-21 mimics+ pmirGLO-PTEN-Mut（mimics + Mut組）、scramble + pmirGLO-PTEN-Mut（NC+Mut 組）分別共轉(zhuǎn)染至對數(shù)期生長HTR-8/SVneo 細(xì)胞，每組6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h 后，收集各組細(xì)胞，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒測定各組細(xì)胞相對熒光信號強(qiáng)度，具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 miR

-

21 及PTEN 在PE 病人及正常胎盤組織中表達(dá)情況比較

以正常胎盤組織中miR-21、PTEN mRNA 表達(dá)水平為1，PTEN 蛋白表達(dá)水平為（0.45±0.06），PE胎盤組織中miR-21（0.41±0.05）表達(dá)水平顯著降低（

t

=79.157，

P

=0.000），PTEN mRNA（4.13±0.58）及蛋白（0.91±0.08）表達(dá)水平均顯著增加（

t

=36.201、30.858，

P

=0.000、0.000）。PE胎盤組織中miR-21與PTEN表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（

r

=-0.542，

P

＜0.05）。

2.2 miR

-

21對HTR

-

8/SVneo細(xì)胞侵襲的影響

BC組、NC組、mimics組和inhibitor組HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲個(gè)數(shù)分別為200.08±19.87、198.57±19.49、325.38±36.74、85.27±10.13，與BC、NC 組比較，mimics 組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增加（

q

=13.01、13.16，

P

=0.00、0.00），inhibitor 組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少（

q

=11.92、11.76，

P

=0.00、0.00），均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

F

=103.70，

P

=0.00）。

2.3 miR

-

21對HTR

-

8/SVneo細(xì)胞凋亡的影響

結(jié)果見圖1。BC組、NC組、mimics組和inhibitor組HTR-8/SVneo 細(xì)胞凋亡率分別為16.24±2.11、17.67±2.23、9.29±1.35、41.48±3.07，與BC組、NC組比較，mimics組凋亡率顯著降低（

q

=7.49、9.03，

P

=0.00、0.00），inhibitor組凋亡率顯著增加（

q

=27.20、25.65，

P

=0.00、0.00），均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

F

=228.40，

P

=0.00）。

2.4 miR

-

21 靶基因生物信息學(xué)分析

miRTarBase軟件預(yù)測miR-21 與PTEN3ˊUTR 區(qū)存在靶向結(jié)合位點(diǎn)。見圖2。

2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

以轉(zhuǎn)染NC+Wt相對熒光活性值為1，即（1.00±0.00），轉(zhuǎn)染mimics+Wt 后HTR-8/SVneo細(xì)胞相對熒光活性（0.39±0.04）顯著降低（

t

=37.355，

P

=0.000）。以轉(zhuǎn)染NC+Mut相對熒光活性值為1，轉(zhuǎn)染mimics+Mut后HTR-8/SVneo細(xì)胞相對熒光活性為（1.03±0.12），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=0.612，

P

=0.554）。

2.6 miR

-

21 對HTR

-

8/SVneo 細(xì)胞PTEN、p

-

PI3K、p

-

Akt 蛋白表達(dá)的影響

與BC、NC 組比較，mimics組PTEN 表達(dá)水平顯著降低（

q

=8.71、9.33，

P

=0.00、0.00），p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)水平顯著增加（

q

=15.03、15.70、17.66、16.91，

P

=0.00、0.00、0.00、0.00），inhibitor 組PTEN 蛋白表達(dá)水平顯著增加（

q

=20.53、19.91，

P

=0.00、0.00），p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)水平顯著 降 低（

q

=12.70、12.03、7.51、8.27，

P

=0.00、0.00、0.00、0.00）。見表1、圖3。

圖1 凋亡流式術(shù)檢測miR-21對HTR-8/SVneo細(xì)胞凋亡的影響：A為BC組；B為NC組；C為Mimics組；D為Inhibitor組

圖2 miR-21與PTEN 3ˊUTR區(qū)的靶向結(jié)合位點(diǎn)

3 討論

研究表明，多種miRNAs與PE發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Schlosser等研究報(bào)道，循環(huán)miR-206和Wnt信號與女性PE病史及預(yù)后心血管疾病有關(guān)。Xie等研究報(bào)道，miR-320a上調(diào)通過靶向白細(xì)胞介素4抑制滋養(yǎng)細(xì)胞生長和侵襲，促進(jìn)PE發(fā)生。Dong等研究報(bào)道，與對照組比較，晚發(fā)性PE病人循環(huán)中miR-21表達(dá)水平下調(diào)，有望成為晚發(fā)性PE的診斷標(biāo)志。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，PE組病人胎盤組織中miR-21表達(dá)水平顯著降低，與其在癌癥中表達(dá)趨勢相反，可能與疾病異質(zhì)性有關(guān)，提示miR-21與PE發(fā)生有關(guān)。

PTEN 即第10號染色體缺失性磷酸酶和張力蛋白同源物基因，是一個(gè)經(jīng)典抑癌基因，其表達(dá)產(chǎn)物PTEN 蛋白同時(shí)具有磷脂酸酶和蛋白磷酸酶活性，在細(xì)胞生長發(fā)育、增殖凋亡、遷移、侵襲、信號傳遞等方面起重要調(diào)控作用，與PE 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Wu 等研究報(bào)道，PE 病人中PTEN 顯著上調(diào)，過表達(dá)長鏈非編碼RNA TCL6 可抑制滋養(yǎng)細(xì)胞增殖促進(jìn)PE 發(fā)展，與靶向抑制PTEN 表達(dá)有關(guān)。Xue 等研究報(bào)道，PTEN 表達(dá)增加可通過調(diào)控AP-1 NF-κB 通路導(dǎo)致HTR-8/SVneo 細(xì)胞侵襲能力降低，促進(jìn)PE 發(fā)展。薛平平等研究報(bào)道，過表達(dá)PTEN 可通過抑制PI3K/Akt 通路激活下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白MMP-2、MMP-9 等表達(dá)抑制細(xì)胞遷移和侵襲，影響絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞侵入，促進(jìn)PE發(fā)生。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，PE組孕婦胎盤組織中PTEN顯著增加，與miR-21呈負(fù)相關(guān)。且本研究通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染NC+Wt比較，轉(zhuǎn)染mimics+Wt 后HTR-8/SVneo 細(xì)胞相對熒光活性顯著降低，提示PTEN 是miR-21 下游靶向調(diào)控基因，PE發(fā)生可能二者表達(dá)水平異常有關(guān)。

miR-21 靶基因繁多，調(diào)控通路復(fù)雜，其中miR-21 靶向PTEN 調(diào)控PTEN/PI3K/Akt 通路影響腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)活性相關(guān)研究屢見不鮮，但關(guān)于miR-21 靶向PTEN 對HTR-8/SVneo 細(xì)胞的研究尚鮮有。王輝等研究報(bào)道，AS-miR-21 通過負(fù)調(diào)控PTEN/PI3K/Akt 信號通路抑制非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞增殖、遷移。李欣然等研究報(bào)道，上調(diào)miR-21 可靶向抑制PTEN、PDCD4 基因表達(dá)對化療誘導(dǎo)卵巢早衰大鼠具有顯著治療作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與BC 組、NC 組比較，mimics 組HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)水平顯著增加，凋亡率、PTEN 蛋白表達(dá)水平顯著降低，inhibitor 組呈相反趨勢，提示過表達(dá)miR-21 可促進(jìn)TR-8/SVneo 細(xì)胞侵襲，抑制其凋亡，可能與下調(diào)PTEN 蛋白表達(dá)激活PI3K/Akt 通路有關(guān)，抑制miR-21則呈相反趨勢可再次印證以上結(jié)果。

表1 HTR-8/SVneo細(xì)胞PTEN、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)比較/±s

圖3 HTR-8/SVneo細(xì)胞中PTEN、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)WB檢測結(jié)果

綜上所述，miR-21 在PE 病人胎盤組織中低表達(dá)，過表達(dá)miR-21 可通過靶向抑制PTEN 表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞侵襲并抑制其凋亡，可能與促進(jìn)PI3K/Akt 通路激活有關(guān)，敲低miR-21 表達(dá)與之結(jié)果相反，可能對臨床PE 發(fā)病機(jī)制及治療提供新的靶點(diǎn)。本研究尚存在不足之處，miR-21 靶點(diǎn)基因繁多，是否有其他靶基因與PTEN 共同參與PE 發(fā)生及TR-8/SVneo 細(xì)胞侵襲，尚不清楚，有待進(jìn)一步深入探究。