董旭,韓學昌,邢群智,葛軍蒲,閆向彪
作者單位:河南科技大學第一附屬醫(yī)院麻醉科,河南 洛陽471003
地佐辛是苯嗎啡烷類衍生物,作為K 受體的激動劑,也是μ 受體的拮抗劑。近年被認為是一種新型的麻醉劑,其擁有不良反應低,無明顯的依賴性等優(yōu)點。但目前地佐辛作用于慢性壓迫性疼痛(chronic constriction injury,CCI)的藥理機制并未非常明確。膠質細胞具有保護神經(jīng)元的功能、并為其提供營養(yǎng)、促進代謝、參加突觸的形成。使用麻醉劑后對神經(jīng)元產(chǎn)生的影響與其膠質細胞有著密切的關聯(lián)。本研究通過對大鼠脊髓L3~4 節(jié)段膠質細胞特異性蛋白(Iba-1)和膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)蛋白表達情況進行檢測,探討地佐辛對大鼠膠質細胞活性及鎮(zhèn)定痛效能的影響。
1.1 實驗動物
2018年10月至2020年10月,選取雄性SD 大鼠40 只,體質量范圍160~190 g,無任何頭部頸部淤血等外傷。由鄭州大學實驗動物中心提供。動物許可證號SYXK(豫)2020-0008。大鼠自由攝食飲水,飼養(yǎng)溫度(25.5±1.0)℃,分籠飼養(yǎng)。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。本研究過程嚴格按照國際疼痛研究協(xié)會(IASP)關于進行動物疼痛實驗的綱要實施完成。采用隨機數(shù)字表法將大鼠分四組,每組10只。1.2 藥品、試劑及儀器
Iba-1、GFAP一抗和羊抗兔IgG 抗體均來自美國Protein Technology 公司,ECL 發(fā)光試劑盒來自美國Thermo 公司。凝膠成像分析儀來自美國BIO-RAD。地佐辛注射液(揚子江藥業(yè)集團有限公司,批準文號H20080329,批次17054565,每支1 mL/5 mg)。GFAP 抗體,美國Abcam 公司生產(chǎn)。VonFrey電子測痛儀、熱輻射刺激儀。1.3 實驗分組
對照組不進行CCI 造模及地佐辛治療;模型組進行CCI造模但不進行地佐辛治療;低劑量組CCI 造模加低劑量地佐辛治療;高劑量組CCI 造模加高劑量地佐辛治療。于手術后即刻至術后7 d,低劑量組給予腹腔注射2.5 mg/kg 的地佐辛、高劑量組給予腹腔注射10 mg/kg 的地佐辛,低劑量組和高劑量組分別給予2.5 mg/kg、10 mg/kg 的地佐辛,稀釋至5 mL 給予腹腔注射,對照組和模型組給予腹腔注射等容積的0.9%生理鹽水。1.4 大鼠CCI 模型的制作
用10%的水合氯醛4 μL/g對大鼠進行腹腔注射麻醉,麻醉后,經(jīng)股二頭肌將大鼠的左后肢位于大腿中后部分的皮膚進行間隙鈍性分離,暴露大鼠的坐骨神經(jīng)干后將其與周圍的軟組織進行分離;定位于坐骨神經(jīng)分成三股前的主干部位,大致在游離神經(jīng)7 mm 左右,輕度地對坐骨神經(jīng)進行結扎,最優(yōu)以神經(jīng)外模收到輕度的壓力;強度的標準為引起小腿肌肉顫動。一共對其坐骨神經(jīng)進行4 道結扎,其間距為1 mm。此時制作成CCI 模型,在手術結束之前對大鼠前肢進行肌肉注射4萬單位青霉素。為保證本研究中的模型制作中盡量不出現(xiàn)偏差,均采取專人進行模型制作,結扎時大鼠側肢出現(xiàn)輕微的抽動且術側后爪無法承受重力,足趾開始并攏且呈輕度外翻或出現(xiàn)自發(fā)性縮足反射等現(xiàn)象為模型制作成功。對照組對大鼠的坐骨神經(jīng)只進行對空氣暴露,不進行神經(jīng)結扎。1.5 測定指標與方法
1.5.1
機械縮足反射閾值及熱縮足反射潛伏期的測定①使用VonFrey 電子測痛儀對大鼠的病側后足的機械疼痛閾值(Mechhanical withdral threshold,MWT)進行測量:將大鼠放置于籠內,等待30 min 使其適應環(huán)境鎮(zhèn)定下來后使用VonFrey 電子測痛儀針尖對大鼠的病側足后第三、四組的足底皮膚進行垂直刺激,當大鼠出現(xiàn)極為迅速的縮足會舔足系列動作則記為大鼠的MWT。②使用熱輻射刺激儀對大鼠的熱縮足反射潛伏期(Thermalpaw withdral wallatency,TWL)進行測量;使用光斑直徑0.8 cm 的熱輻射刺激儀按照Hargreaves 法對大鼠的足底中后處1/3 處進行照射,當大鼠出現(xiàn)收足、舔足、抬足甚至撕咬即認為大鼠的TWL。對建模后大鼠第1 d、第3 d、第5 d、第7 d 的MWT、TWL進行測定及比較,間隔3分鐘進行1次測定,將切斷時間設置為20 s。
1.5.2
Western blotting 檢測大鼠L3~4 節(jié)段脊髓Iba-1、GFAP 蛋白表達水平 對大鼠的MWT 及TWL結束測量后,使用10%水合氯醛(400 mg/kg)對大鼠進行腹腔注射麻醉后快速斷頭,使其冰浴的同時迅速取其L3~4節(jié)段脊髓,用液氮進行保存,加入含有磷酸蛋白酶抑制劑的SDS 緩沖液(按每毫克組織10 mL/mg 標準)和蛋白酶,將樣品用沸水浴5 min后進行BCA 法測定蛋白濃度,應用濕轉膜法將等量采用電泳的蛋白樣品10%SDS-聚丙烯酰胺轉移到PVDF 膜。用5%的脫脂牛奶進行60 min 的封閉后在4 ℃分別用1∶200的一抗Iba-1及1∶2 000的GFAP在搖床孵育過夜。洗膜后用ECL 發(fā)光試劑盒在凝膠成像分析儀處理。用Image Lab 軟件條帶的平均灰度值代表GFAP蛋白表達水平。2.1 各組大鼠脊髓中Iba
-1 及GFAP 的表達水平
單因素方差分析,各指標整體差異有統(tǒng)計學意義(P
<0.05)。多重比較并結合主要數(shù)據(jù)分析:大鼠脊髓中Iba-1 及GFAP 的表達水平模型組蛋白表達水平最高,對照組水平最低。對照組與模型組,低、高劑量組與模型組的Iba-1、GFAP 表達水平,均差異有統(tǒng)計學意義(均P
<0.05),見表1,圖1。表1 各組大鼠脊髓中中Iba-1及GFA的表達水平比較/±s
圖1 Western blotting檢測各組大鼠脊髓Iba-1、GFAP的蛋白表達電泳圖
2.2 各組大鼠疼痛行為學檢測結果
整體比較(兩因素重復測量方差分析)知:各指標組間差異、時間差異及交互作用均差異有統(tǒng)計學意義(P
<0.05)。兩兩精細比較:低劑量組、高劑量組在CCI造模后不同時間段出現(xiàn)了行走時抬足、跛行、足外翻等行為學變化,MWT 和TWL 均明顯下降(P
<0.05);與模型組相較,低劑量組和高劑量組在接受地佐辛治療后行為學變化有緩解,MWT 和TWL 回升(P
<0.05),高劑量組同時間點TWL 高于低劑量組(P
<0.05),而兩組同時間點MWT差異無統(tǒng)計學意義(P
>0.05)。見表2。表2 各組大鼠疼痛行為學檢測結果(n=10)/±s
神經(jīng)性疼痛(Neuropathic pain,NPP)是一種當感覺神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷或者發(fā)生疾病時對軀體直接發(fā)生的疼痛。表現(xiàn)為痛覺過敏、感覺異常、自發(fā)性疼痛、異常疼痛等。膠質細胞是一種支持細胞,分布于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng),支持并引導神經(jīng)元遷移,對整個神經(jīng)系統(tǒng)的修復和再生進行參與,并且參與機體的免疫應答,在形成髓鞘、血腦屏障、物質代謝及維持細胞外鉀離子的濃度等方面進行作用。膠質細胞與神經(jīng)元的關系在神經(jīng)生物學科成為最新熱點,神經(jīng)元在大腦中承擔著重要作用,參與釋放遞質等影響突觸活動。近年來大量的研究證實膠質細胞與NPP 有關。王伍超等研究顯示,膠質細胞在活化后會對神經(jīng)炎癥及免疫反應進行主導,而神經(jīng)炎癥和免疫反應在NPP 的發(fā)生和維持上發(fā)揮著重要作用,發(fā)生神經(jīng)損傷后的膠質細胞神經(jīng)外周到中樞釋放出細胞因子及炎性因子加速NPP 發(fā)生,因此調控膠質細胞活性或許是研究NPP的新方向。
地佐辛是阿片受體混合激動-拮抗劑,具有優(yōu)越的鎮(zhèn)痛作用。其成癮性較小、對呼吸抑制作用較弱,在人體內吸收快、分布快,因此鎮(zhèn)痛起效快、鎮(zhèn)痛久等優(yōu)點。臨床上將其廣泛在術后鎮(zhèn)痛、全麻誘導等方面運用。Welch 等研究在大鼠上建立CCI 模型后給予嗎啡會升高大鼠在術后的MWT,以此來推測地佐辛是否會有類似作用。而鮑楊等的研究結果顯示,術后切口痛大鼠給予地佐辛能明顯升高痛閾,認為地佐辛對術后切口痛具有明顯的鎮(zhèn)痛作用。而本研究中大鼠在建模后的MWT、TWL水平均較低,在兩種不同劑量地佐辛干預下的MWT、TWL均呈現(xiàn)出一定水平的升高,與Welch等及李海鷗的研究結論類似,提示地佐辛對疼痛及神經(jīng)反射有著抑制作用,且還發(fā)現(xiàn)高劑量和低劑量對升高MWT、TWL水平均有效果,但兩種劑量對MWT影響間的差異并無統(tǒng)計學意義,高劑量的地佐辛可能并不能提高對坐骨神經(jīng)壓迫性疼痛的抑制作用。Iba-1為膠質細胞特異性蛋白,其陽性蛋白水平可以作為膠質細胞的標志蛋白之一;GFAP是膠質細胞的標志蛋白及主要骨架成分。GFAP 可以在一定程度上反映膠質細胞活化的狀態(tài),因此可以檢測GFAP 水平來對膠質細胞進行監(jiān)測。本研究結果顯示,對照組GFAP 熒光強度值高于模型組、低劑量組及高劑量組,表明地佐辛可抑制大鼠脊髓膠質細胞GFAP 的表達。同時,隨著地佐辛劑量的增加,GFAP熒光強度值開始降低,地佐辛發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用可能與抑制膠質細胞的活化有關聯(lián)。
綜上所述,本研究推測地佐辛在鎮(zhèn)痛的同時又可抑制脊髓膠質細胞的活化:抑制大鼠脊髓膠質細胞活性以至下調GFAP 的表達,但由于NPP 的發(fā)病機制復雜,應擴大大鼠數(shù)量進行多中心合作以此探索地佐辛在治療NPP的機制及臨床效果。