柳月霞，魏菊紅，劉小麗

作者單位：南陽市第二人民醫(yī)院產(chǎn)一科，河南 南陽473000

宮頸癌是臨床常見惡性腫瘤之一，近年來，宮頸癌發(fā)病率逐年上升，已嚴重威脅女性身體健康，臨床常采用化療等方法治療中晚期宮頸癌病人，但部分病人可產(chǎn)生化療藥物耐藥性從而降低治療效果。因而如何增強宮頸癌化療敏感新成為熱點研究問題。研究表明細胞自噬在宮頸癌發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，還可參與化療耐藥性發(fā)生過程。長鏈編碼RNA 膀胱癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（Long noncoding RNA bladder cancer-associated transcript 1，LncRNA BLACAT1）在非小細胞肺癌中呈高表達，沉默BLACAT1表達可抑制細胞增殖。但BLACAT1對宮頸癌細胞自噬及順鉑敏感性的影響尚未可知。生物信息學分析顯示微小RNA-20b-5p（microRNA-20b-5p，miR-20b-5p）可能是BLACAT1下游的靶基因，研究表明miR-20b-5p在肺腺癌中呈低表達，并可抑制腫瘤細胞增殖。因此，本研究主要探討B(tài)LACAT1、miR-20b-5p在宮頸癌細胞株與耐藥細胞株中的表達，分析其對細胞自噬及順鉑敏感性的影響機制，以期為宮頸癌治療藥物的研發(fā)提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人正常宮頸上皮細胞HUCEC、宮頸癌細胞株ME180、C-33A、Hela 購自美國ATCC公司；順鉑耐藥宮頸癌細胞株Hela/DDP 購自廣州吉妮歐生物；甲基噻唑基四唑（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）購自上海澤葉生物；Lipofectamine2000 購自美國Invitrogen；Trizol、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量試劑盒購自北京天根生化；BLACAT1 小分子干擾RNA（si-BLACAT1）及其陰性對照（si-NC）、miR-20b-5p 特異性寡核苷酸抑制劑（anti-miR-20b-5p）及其陰性對照（anti-miR-NC）、miR-20b-5p 寡核苷酸模擬物（miR-20b-5p mimics）及陰性對照mimic NC 序列（miRcon）購自上海吉瑪；兔抗人p62、微管相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅰ（LCB3-Ⅰ）、微管相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅱ（LCB3-Ⅱ）抗體購自美國CST；二抗購自武漢博士德生物。

1.2 方法

1.2.1

實驗分組 本研究起止時間2018年6月至2019年10月。取對數(shù)期Hela/DDP 細胞，按照隨機數(shù)字表法分為si-NC 組（轉(zhuǎn)染si-NC）、si-BLACAT1 組（轉(zhuǎn) 染si-BLACAT1）、si-BLACAT1+anti-miR-NC 組（共轉(zhuǎn)染si-BLACAT1與anti-miR-NC）、si-BLACAT1+anti-miR-20b-5p 組（共轉(zhuǎn)染si-BLACAT1 與anti-miR-20b-5p），各組轉(zhuǎn)染前2 h 更換為不含胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染6 h 后更換為DMEM 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞。

1.2.2

qRT-PCR 檢測細胞中BLACAT1、miR-20b-5p 的表達水平 采用Trizol 法提取各組細胞中總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qRT-PCR 反應體系：SYBR Green Master Mix 10 μL，正反向引物0.8 μL，cDNA 1 μL，雙蒸水（ddHO）補 足 體 系 至20 μL，用2法 計 算BLACAT1、miR-20b-5p的表達水平。

1.2.3

MTT 檢測細胞順鉑IC50 值 取對數(shù)期Hela/DDP細胞接種于96孔板（100 μL/孔），采用0.5、5、8、10、20 μg/mL 順鉑處理72 h，每孔加入15 μL MTT 溶液，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，利用酶標儀檢測OD，用Msvbvm50軟件計算細胞抑制率為50%時的順鉑濃度即順鉑IC50值。

1.2.4

雙熒光素酶報告基因檢測BLACAT1 的靶基因 構(gòu)建野生型載體WT-BLACAT1、突變型載體MUT-BLACAT1，分別將WT-BLACAT1、MUT-BLACAT1 與miR-con、miR-20b-5p mimics 共轉(zhuǎn)染至Hela/DDP 細胞，37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，參照熒光素酶活性檢測試劑盒檢測各組熒光素酶活性。

1.2.5

蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測p62、LCB3-Ⅰ、LCB3-Ⅱ蛋白表達 提取各組Hela/DDP細胞蛋白，用SDS-PAGE 分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入p62（1∶800）、LCB3-Ⅰ（1∶1 000）、LCB3-Ⅱ（1∶1 000）一抗稀釋液，4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌，加入二抗稀釋液（1∶2 000），滴加ECL 顯影，應用Quantityone 軟件檢測條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 BLACAT1 在宮頸癌細胞中的表達

與HUCEC 相比，宮頸癌細胞株ME180、C-33A、Hela 中BLACAT1 的表達水平升高[（0.80±0.16）比（3.41±0.14）、（3.72±0.14）、（2.52±0.15）］（

P

＜0.05）；與Hela相比，Hela/DDP 細胞中BLACAT1 的表達水平升高[（2.52±0.15）比（5.23±0.14）］（

P

＜0.05）。

2.2 BLACAT1 敲減抑制Hela/DPP 細胞自噬和增強細胞對順鉑藥物敏感性

與si-NC組相比，si-BLACAT1組細胞中BLACAT1的表達水平降低（

P

＜0.05），p62蛋白水平降低（

P

＜0.05），LCB3-Ⅱ蛋白水平升高（

P

＜0.05），順鉑IC50值降低（

P

＜0.05），見圖1、表1。

圖1 BLACAT1敲減對順鉑處理的宮頸癌Hela/DDP細胞中自噬相關(guān)蛋白表達的影響

表1 BLACAT1敲減對順鉑處理的宮頸癌Hela/DDP細胞自噬相關(guān)蛋白表達的影響（n=9）/±s

2.3 BLACAT1 靶向結(jié)合miR

-

20b

-

5p

BLACAT1與miR-20b-5p 存在結(jié)合位點，見圖2。miR-20b-5p過表達可降低野生型載體WT-BLACAT1 的熒光素酶活性（

P

＜0.05），見表2。

表2 雙熒光素酶活性檢測Hela/DDP細胞中BLACAT1與miR-20b-5p的靶向關(guān)系（n=9）/±s

圖2 BLACAT1與miR-20b-5p的結(jié)合位點

2.4 miR

-

20b

-

5p 在宮頸癌細胞中的表達

與HUCEC 相比，宮頸癌細胞株ME180、C-33A、Hela 中miR-20b-5p 的表達水平降低[（1.00±0.16）比（0.42±0.16）、（0.33±0.14）、（0.38±0.15）］（

P

＜0.05）；與Hela相比，Hela/DDP 細胞中miR-20b-5p 的表達水平降低[（0.38±0.15）比（0.21±0.11）］（

P

＜0.05）。

2.5 miR

-

20b

-

5p 的敲減逆轉(zhuǎn)了BLACAT1 敲減對Hela/DDP 細胞自噬及順鉑敏感性的影響

與si-NC組相比，si-BLACAT1組細胞中miR-20b-5p的表達水平升高（

P

＜0.05）；與si-BLACAT1+anti-miR-NC 組相比，si-BLACAT1+anti-miR-20b-5p組細胞中miR-20b-5p 的表達水平降低（

P

＜0.05），p62 蛋白水平顯著升高（

P

＜0.05），LCB3-Ⅱ蛋白水平降低（

P

＜0.05），順鉑IC50值顯著升高（

P

＜0.05），見圖3、表3。

表3 miR-20b-5p的敲減逆轉(zhuǎn)了BLACAT1敲減對順鉑處理的Hela/DDP細胞自噬相關(guān)蛋白表達的影響（n=9）/±s

3 討論

既往研究顯示增強宮頸癌細胞自噬活性可能抑制腫瘤進展，如何將化療藥物與自噬誘導劑結(jié)合成為重點研究。但宮頸癌細胞自噬相關(guān)分子機制尚未完全闡明。研究表明LncRNA 在宮頸癌中異常表達并可調(diào)控細胞生物學行為。

圖3 miR-20b-5p的敲減逆轉(zhuǎn)了BLACAT1敲減對Hela/DDP細胞自噬相關(guān)蛋白表達的影響

BLACAT1在多種惡性腫瘤中呈高表達，并可作為腫瘤診斷及評估病人預后的重要指標。研究表明抑制BLACAT1 表達可降低非小細胞肺癌對阿法替尼的耐藥性。相關(guān)報道指出BLACAT1 在肝細胞癌中表達量升高，并可促進腫瘤細胞生長。與既往研究結(jié)果相似，本研究結(jié)果顯示BLACAT1在宮頸癌細胞株中的表達量增高，在宮頸癌耐藥細胞株中的表達明顯高于宮頸癌細胞，提示BLACAT1高表達可能促進宮頸癌細胞耐藥性的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示抑制BLACAT1 表達后宮頸癌細胞中p62蛋白表達量降低，LCB3-Ⅱ蛋白表達量升高。研究表明LCB3-Ⅱ、LCB3-Ⅰ屬于自噬標志物，細胞發(fā)生自噬時LCB3-Ⅱ表達升高，p62 屬于自噬標記蛋白，p62 表達量升高可促進腫瘤發(fā)展。本研究結(jié)果提示抑制BLACAT1 表達可調(diào)控細胞自噬過程。同時本研究結(jié)果顯示抑制BLACAT1 表達可能通過調(diào)節(jié)細胞自噬從而增強順鉑敏感性。

子宮內(nèi)膜癌中LncRNA H19 通過抑制miR-20b-5p 表達從而促進腫瘤發(fā)生及發(fā)展。研究表明miR-20b-5p 在結(jié)腸癌、骨肉瘤等腫瘤中呈低表達，并可參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程。與上述研究報道結(jié)果相似，本研究結(jié)果顯示miR-20b-5p 在宮頸癌細胞中呈低表達，且在宮頸癌耐藥細胞中的表達水平較低，提示miR-20b-5p 表達量減低可能降低宮頸癌細胞順鉑敏感性。本研究證實BLACAT1 能夠靶向結(jié)合miR-20b-5p，抑制BLACAT1表達可能通過上調(diào)miR-20b-5p 表達從而促進宮頸癌細胞自噬進而增強細胞順鉑敏感性。

綜上所述，BLACAT1與miR-20b-5p可參與宮頸癌細胞的順鉑耐藥性過程，抑制BLACAT1表達可能通過上調(diào)miR-20b-5p 表達而增強宮頸癌細胞自噬活性從而提高細胞的順鉑敏感性，可為宮頸癌的治療提供潛在靶點。