馬永紅，同娟

作者單位：寶雞市中心醫(yī)院耳鼻喉科，陜西 寶雞721000

鼻咽癌是一種發(fā)病率較高的常見頭頸部腫瘤，其死亡率居于頭頸部惡性腫瘤的前列。在我國(guó)，南方鼻咽癌的發(fā)病率高于北方，每年新增病人占全世界鼻咽癌新增病例的一半以上。鼻咽癌具有發(fā)病隱匿、轉(zhuǎn)移性強(qiáng)等臨床特點(diǎn)。目前，臨床常采用放化療結(jié)合治療鼻咽癌，但由于病人的放化療抵抗性極大限制了治療效果，嚴(yán)重影響鼻咽癌病人的5年生存率。近年來，發(fā)現(xiàn)分子靶向治療具有特異性強(qiáng)、副作用小等特點(diǎn)，成為臨床探究鼻咽癌治療的重點(diǎn)。近年來的研究證實(shí)，屬于膠原蛋白家族的Ⅰ型膠原α1 鏈（COL1A1）基因在乳腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤組織中表達(dá)量顯著增加，下調(diào)COL1A1抑制細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，表明在腫瘤的病理演進(jìn)過程中其發(fā)揮促進(jìn)作用。但COL1A1在鼻咽癌中的作用尚不十分清楚，因此2017年9月至2018年12月，本研究通過小干擾RNA（Small interference RNA）下調(diào)鼻咽癌細(xì)胞中COL1A1的表達(dá)量，研究其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，為鼻咽癌的臨床治療提供分子靶位點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鼻咽癌各細(xì)胞系（C666-1、CNE1、CNE2）以及人鼻咽上皮細(xì)胞（NP69）均購(gòu)自北納生物，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Lipofectamine 2000、RNA試劑提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，噻唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自美國(guó)Bio Basic Inc公司；siRNA COL1A1以及陰性對(duì)照購(gòu)自上海吉瑪公司，COL1A1抗體、鈣黏蛋白E（E-cadherin）抗體、波形蛋白（Vimentin）抗體、鈣黏蛋白N（N-cadherin）抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。酶標(biāo)儀、qPCR儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng)

鼻咽癌各細(xì)胞系（C666-1、CNE1、CNE2）培養(yǎng)于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，5%二氧化碳、37 ℃培養(yǎng)箱孵育，每2～3 天加入胰酶消化、傳代。

1.3 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

選取生長(zhǎng)良好的CNE1細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組（常規(guī)培養(yǎng)）、si-NC組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照）、si-COL1A1組（轉(zhuǎn)染siRNA COL1A1）。在Lipofectamine 2000說明書指示將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和Lipofectamine 2000分別進(jìn)行稀釋、混合，加入每孔細(xì)胞中培養(yǎng)4～6 h，更換培養(yǎng)基，置于5%二氧化碳、37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 qPCR實(shí)驗(yàn)

采用RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞中總RNA，在反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書指示下合成cDNA。以鼠抗人三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)條件為95 ℃5 min，95 ℃30 s，62 ℃30 s，72 ℃1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃10 min，目的基因的表達(dá)量采用2法進(jìn)行計(jì)算。其中，COL1A1引物（正向引物為5，-GTTGTGCGATGACGTGATCTGT-3， ，反向引物為5，-TTGGTCGGTGGGTGACTCTG-3，）以及GAPDH 引物（正向引物為5，-CTG GGCTAC ACTGAGCACC-3，，反向引物為5，-AAG TGG TCG TTG AGGGCA ATG-3，）由上海生工合成。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 MTT 實(shí)驗(yàn)

收集各組CNE1 細(xì)胞，將5×10個(gè)CNE1細(xì)胞接種至96孔板，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，每孔CNE1細(xì)胞中加入20 μL MTT，37 ℃孵育4 h，每孔CNE1細(xì)胞中加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm吸光值，記為A值。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)

在侵襲實(shí)驗(yàn)前，Transwell上室膜中提前覆蓋Matrigel膠稀釋液，而遷移實(shí)驗(yàn)無(wú)須此過程。收集各組CNE1細(xì)胞，將5×10個(gè)CNE1細(xì)胞加入Transwell上室，將600 μL含15%胎牛血清的培養(yǎng)基加入下室，培養(yǎng)24 h；PBS清洗、棄去殘留細(xì)胞，甲醛固定、結(jié)晶紫染色各30 min，顯微鏡取5個(gè)區(qū)域拍照、計(jì)數(shù)，取平均值。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）

收集各組CNE1細(xì)胞，RIAP裂解液提取CNE1細(xì)胞總蛋白，10%SDS-PAGE 凝膠為介質(zhì)，進(jìn)行電泳，挑選目的條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜。置于5%封閉液孵育2 h，TBST清洗3次，加入COL1A1（1∶200）、E-cadherin一抗（1∶5 000）、Vimentin 一抗（1∶5 000）、N-cadherin 一抗（1∶2 000）、GAPDH一抗（1∶10 000），辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（1∶1 000）孵育，加入ECL發(fā)光液，曝光、顯影、定影，檢測(cè)目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。

2 結(jié)果

2.1 COL1A1在細(xì)胞系中的表達(dá)量

與人鼻咽上皮細(xì)胞（NP69）相比，COL1A1 mRNA和蛋白表達(dá)量在鼻咽癌各細(xì)胞系（C666-1、CNE1、CNE2）中表達(dá)量增加（

P

＜0.05），其中在CNE1細(xì)胞中的表達(dá)量最高。結(jié)果如表1、圖1所示，

表1 各組細(xì)胞中COL1A1的表達(dá)量/±s

圖1 各組細(xì)胞中COL1A1蛋白的表達(dá)量

2.2 轉(zhuǎn)染siRNA COL1A1 對(duì)細(xì)胞中COL1A1 表達(dá)量的影響及敲低COL1A1 對(duì)CNE1 細(xì)胞增殖的影響

將siRNA COL1A1以及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染入CNE1細(xì)胞系中，從而敲低COL1A1的表達(dá)量，與對(duì)照組相比，COL1A1在si-NC組細(xì)胞中表達(dá)量變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在si-COL1A1 組細(xì)胞中表達(dá)量下降（

P

＜0.05）。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染陰性CNE1細(xì)胞增殖活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但敲低COL1A1 的表達(dá)量降低CNE1細(xì)胞增殖活性（

P

＜0.05）。見表2、圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染siRNA COL1A1對(duì)細(xì)胞中COL1A1蛋白表達(dá)量的影響

表2 轉(zhuǎn)染siRNA COL1A1對(duì)細(xì)胞中COL1A1表達(dá)量的影響及敲低COL1A1對(duì)CNE1細(xì)胞增殖的影響/±s

2.3 敲低COL1A1 對(duì)CNE1 細(xì)胞遷移、侵襲及上皮細(xì)胞間充質(zhì)化（EMT）相關(guān)蛋白水平的影響

與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照的CNE1細(xì)胞侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著變化，但敲低COL1A1的表達(dá)量降低CNE1細(xì)胞侵襲、遷移數(shù)目（

P

＜0.05）。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照的CNE1 細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 蛋白表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但敲低COL1A1的表達(dá)量增加E-cadherin蛋白水平、降低Ncadherin、Vimentin 蛋白水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。見表3，圖3。

表3 敲低COL1A1對(duì)CNE1細(xì)胞遷移、侵襲及EMT相關(guān)蛋白水平的影響/±s

圖3 敲低COL1A1對(duì)CNE1細(xì)胞的影響：A為EMT相關(guān)蛋白水平的影響；B為遷移和侵襲的影響

3 討論

腫瘤組織的形成過程是癌基因以及抑癌基因相互調(diào)控的過程。因此，探究腫瘤病理演進(jìn)過程中的基因表達(dá)量變化對(duì)探究腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制具有重要的作用。COL1A1基因長(zhǎng)約17 537 bp，位于人染色體17q21.33，包含51個(gè)外顯子，編碼Ⅰ型膠原纖維前體α 2 鏈，是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分。研究發(fā)現(xiàn)，COL1A1在多種腫瘤組織中異常表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在乳腺癌中，COL1A1表達(dá)量異常，且與乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移等過程有關(guān)，參與腫瘤的預(yù)后。在宮頸癌中，COL1A1 的表達(dá)量顯著增加，敲低COL1A1的表達(dá)量可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡率進(jìn)而影響其放療敏感性，參與宮頸癌的放射治療過程。分析顯示，COL1A1在肝癌中表達(dá)量明顯異常，是肝癌病人預(yù)后的潛在靶基因。另外，研究發(fā)現(xiàn)，COL1A1在前列腺癌、喉癌等多種腫瘤病理進(jìn)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

為探究COL1A1在鼻咽癌中的調(diào)控作用，本研究通過qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，COL1A1在鼻咽癌細(xì)胞系C666-1、CNE1、CNE2中的表達(dá)量明顯增加，表明COL1A1參與鼻咽癌的病理進(jìn)程，其中在CNE1細(xì)胞中的表達(dá)量較高，因此作為后續(xù)研究對(duì)象。在Lipofectamine 2000介導(dǎo)下將siRNA COL1A1轉(zhuǎn)染入CNE1細(xì)胞中，qPCR和Western blotting 檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果，結(jié)果顯示，siRNA COL1A1顯著降低CNE1細(xì)胞中COL1A1 mRNA和蛋白的表達(dá)量，表明siRNA COL1A1 質(zhì)?？煞€(wěn)定下調(diào)COL1A1 的表達(dá)量。MTT 和Transwell 法檢測(cè)敲低COL1A1 對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的影響，結(jié)果顯示，COL1A1表達(dá)量降低抑制CNE1細(xì)胞增殖，降低其侵襲、遷移能力，表明COL1A1可通過調(diào)節(jié)鼻咽癌細(xì)胞的生物學(xué)特性，進(jìn)而調(diào)控其腫瘤組織的生長(zhǎng)。

腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移特性受多種基因、信號(hào)通路的調(diào)控，與腫瘤病人的預(yù)后緊密相關(guān)。研究表明，腫瘤組織發(fā)生轉(zhuǎn)移的過程不僅與基因水平相關(guān)，還與上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變形成間質(zhì)細(xì)胞有關(guān)。在生理或病理狀態(tài)下，EMT 的形成過程主要與上皮性標(biāo)志物（Ecadherin）、間質(zhì)性標(biāo)志物（Vimentin、N-cadherin）的水平顯著相關(guān)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展、細(xì)胞遷移過程中發(fā)揮重要作用。為探究COL1A1調(diào)控CNE1細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過Western blotting檢測(cè)細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低COL1A1的表達(dá)量促進(jìn)E-cadherin蛋白表達(dá)，抑制Vimentin、N-cadherin蛋白表達(dá)，表明敲低COL1A1可通過抑制EMT過程，從而影響細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移。

綜上所述，COL1A1在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)量增加；敲低COL1A1表達(dá)量抑制鼻咽癌CNE1細(xì)胞增殖、侵襲、遷移，可能通過影響EMT過程。本實(shí)驗(yàn)只在鼻咽癌CNE1細(xì)胞中探究了COL1A1的作用以及可能分子機(jī)制，未來會(huì)在鼻咽癌多株細(xì)胞系以及動(dòng)物、臨床樣本中進(jìn)一步探究COL1A1參與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的具體作用以及與相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控作用。