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        高效液相色譜法同時測定柚子中的4種黃酮苷和檸檬苦素

        2021-04-08 11:29:14黃雪松
        食品與機械 2021年3期
        關(guān)鍵詞:方法

        張 珊 黃雪松

        (暨南大學理工學院,廣東 廣州 510632)

        二氫黃酮類化合物(包括蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷)[1]和三萜內(nèi)酯化合物檸檬苦素均為柚子中的活性成分,其中柚皮苷和檸檬苦素為苦味物質(zhì),前者造成“直接”苦味,后者呈現(xiàn)“后苦”現(xiàn)象[2-3],兩類物質(zhì)的含量是衡量柚子加工產(chǎn)品質(zhì)量和保健功效的重要品質(zhì)指標,因此兩類物質(zhì)的測定方法成為相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點。

        但現(xiàn)有標準及報道中,這兩類物質(zhì)都是分別測定的,如:GB 1886.262—2016僅規(guī)定了柚皮苷的高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)測定方法;NY/T 2014—2011規(guī)定了同時測定橙皮苷、柚皮苷的HPLC方法;朱露等[4]提出同時測定枳實中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的HPLC方法;蔡艷芳等[5]提出測定枳實中檸檬苦素的HPLC方法,迄今尚未見檸檬苦素與黃酮類物質(zhì)同時測定的報道。試驗擬以柚子幼果和柚子果汁為樣品,研究一種方便、快速、準確且同時測定蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素5種成分的HPLC方法。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        白肉蜜柚幼果(直徑小于5 cm)、白肉蜜柚:廣東順興種養(yǎng)股份有限公司;

        蕓香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷標準品:成都普菲生物技術(shù)有限公司;

        柚皮苷標準品:上海麥克林生化科技有限公司;

        檸檬苦素標準品:上海源葉生物科技有限公司;

        甲醇、乙腈:色譜純:瑞典歐森巴克化學公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        高效液相色譜儀:LC-20A nence型,配SPD-M20A紫外檢測器,島津(廣州)檢測技術(shù)有限公司;

        冷凍干燥機:SCIENTZ-10N型,寧波新芝生物科技股份有限公司;

        二兩裝高速中藥粉碎機:111型,瑞安市永歷制藥機械有限公司;

        高速離心機:HC-3514型,安徽中科中佳科學儀器有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 標準品溶液制備 精確稱取一定量的蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷分別用甲醇溶解于50 mL容量瓶中并定容,制成質(zhì)量濃度分別為1.053,1.363,1.102,1.096 g/L的單標溶液,測定其出峰時間及紫外吸收光譜。

        精確稱取一定量蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素,用甲醇溶解于同一50 mL容量瓶中并定容,制成質(zhì)量濃度分別為1.080,1.146,1.104,1.176,0.812 g/L 的混標母液,用甲醇倍比稀釋至0.50,0.25,1.25×10-1,6.25×10-2,3.13×10-2,1.56×10-2,7.81×10-3,3.91×10-3,1.95×10-3,9.77×10-4倍,測定其濃度。

        1.3.2 樣品制備 精確稱取凍干柚子粉末(100目)樣品0.107 7 g于50 mL容量瓶中,用甲醇定容,超聲提取30 min,用0.45 μm微孔濾膜過濾,待測。

        取新鮮柚子以果肉榨汁,取1 g柚子汁溶于10 mL甲醇,超聲提取30 min后,6 000 r/min離心10 min,取上清液,將上清液與甲醇(V上清液∶V甲醇)以1∶50的比例再次混合,靜置30 min,10 000 r/min離心10 min,取上清液,用0.45 μm微孔濾膜過濾后待測。

        1.3.3 HPLC梯度洗脫方法 參考朱露等[4]和蔡艷芳等[5]的方法,設(shè)計如表1中的5種方法。根據(jù)所獲HPLC色譜圖從中選出最適宜的方法予以評價。

        1.3.4 HPLC測定條件 色譜柱Bio-Bond 5 μm C18(4.6 mm×250 mm);流動相為乙腈(A)和水(B),流速1 mL/min,進樣量10 μL,柱溫40 ℃。配二極管陣列紫外檢測器(PDA),分別在283 nm和220 nm檢測4種黃酮苷和檸檬苦素。

        混標溶液洗脫條件由表1中的5種洗脫方法逐個試用,單標溶液洗脫條件和柚子樣品的洗脫條件為表1中選取的最優(yōu)方法。

        1.3.5 重復(fù)性的測定 取1.3.2中的供試品溶液,制成平行樣品5份,以1.3.4中的HPLC條件進行測定,每份樣品連續(xù)進樣3次,記錄峰面積,分別計算5種成分的含量和相對標準偏差(RSD)。

        1.3.6 精確度與加樣回收率的測定 精密稱取201.5 mg柚子幼果粉末,置于50 mL容量瓶中,分別加入不同質(zhì)量的5種標準品,定容。以1.3.2中的方法處理后,制成平行樣品5份,在1.3.4中的HPLC條件下進行測定,每份樣品連續(xù)進樣3次,記錄峰面積,按式(1)計算平均回收率。用平均回收率和相對標準偏差(RSD)評價精確度高低。

        (1)

        式中:

        R——回收率,%;

        m1——測得量,mg;

        m2——樣品中成分質(zhì)量,mg;

        m3——加標量,mg。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 測定條件的確定

        2.1.1 測定波長 圖1分別為蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素的紫外吸收光譜圖。由圖1(a)~(d)可知,蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的最大吸收波長分別為282,282,283,283 nm,為操作與計算方便,選取283 nm為4種黃酮苷的紫外吸收波長。由圖1(e)可知,當檢測波長<240 nm時,波長越小,檸檬苦素的響應(yīng)值越大,但考慮到既能檢測到檸檬苦素又盡可能減少雜質(zhì)或溶劑導致的紫外吸收誤差,選擇220 nm 為測定檸檬苦素的吸收波長。據(jù)此,定量測定上述5種成分時,檸檬苦素選擇采用220 nm時的吸收峰面積,而4種黃酮則采用283 nm測定時的吸收峰面積。

        表1 5種不同的洗脫程序

        圖2(a)~圖2(e)分別為蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素的單標在方法5的洗脫程序下所獲色譜圖,圖2(f)和圖2(g)為上述5種物質(zhì)的混標在方法5的洗脫程序下所獲色譜圖。由單標和混標的出峰時間對比分析可知,圖2(f)和圖2(g)中峰1~5分別為蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素。

        圖1 4種黃酮苷和檸檬苦素的紫外吸收光譜圖Figure 1 UV absorption spectra of four flavonoid glycosides and limonin

        1. 蕓香柚皮苷 2. 柚皮苷 3. 橙皮苷 4. 新橙皮苷 5. 檸檬苦素圖2 5種標準品在283 nm和220 nm處的色譜圖Figure 2 Chromatograms of 5 standards at 283 nm and 220 nm

        2.1.2 最佳HPLC梯度洗脫條件 如圖3所示,逐步提高流動相中乙腈比例,可使檸檬苦素的出峰時間提前。檸檬苦素出峰時間由方法1中21.15 min提前至方法5中15.84 min[圖2(g)],提前了5.31 min,這是因為C18反相色譜柱的填料以硅膠為基質(zhì),表面鍵合有極性相對較弱的官能團。因此,選擇系統(tǒng)洗脫時間最短的方法5測定4種物質(zhì);在該條件下,各成分的分離度均大于1.5,滿足測定要求[6]。

        2.2 測定方法的可靠性

        2.2.1 標準曲線、線性范圍、檢測限和定量限 在1.3.4的條件下,對不同質(zhì)量濃度的4種黃酮苷與檸檬苦素標準品進行測定。以各組分的峰面積為縱坐標(y),對應(yīng)質(zhì)量濃度為橫坐標(x)繪制標準曲線,得到5種物質(zhì)的線性方程(見表2)。信噪比(S/N)為3時所對應(yīng)的質(zhì)量濃度即為檢出限(LOD),信噪比為10時對應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量下限(LOQ)[7]。

        2.2.2 重復(fù)性 按照1.3.5的處理方法,得出表3的重復(fù)性進樣結(jié)果,其相對標準偏差(RSD)均小于2%,表明此種方法重復(fù)性良好。

        2.2.3 精確度與加樣回收率 按照1.3.6的處理方法,得出表4中一系列結(jié)果,5種成分的平均回收率范圍為98.47%~99.81%,RSD均小于2%,表明此種方法測量精確,回收率良好。

        2.3 柚子幼果與柚子汁中5種物質(zhì)的含量

        根據(jù)上述測定方法與標準曲線,測定按照1.3.5準備的柚子樣品,測得柚子幼果(圖4)中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素的質(zhì)量分數(shù)分別為8.49%,8.05%,1.30%,1.31%,1.46%;測得柚子汁(圖5)中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素的質(zhì)量分數(shù)分別為1.41%,2.63%,0.23%,0.16%,0.78%。

        1. 蕓香柚皮苷 2. 柚皮苷 3. 橙皮苷 4. 新橙皮苷 5. 檸檬苦素圖3 不同洗脫條件下的色譜圖(220 nm)Figure 3 Comparison of tailing of limonoid peaks under different elution conditions (220 nm)

        表2 5種成分的標準曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限、定量限?

        由圖4、圖5可知:4種黃酮物質(zhì)分離度高,峰型好;但檸檬苦素峰型受到樣品中雜質(zhì)的影響,有一定的偏差,需要注意選擇積分曲線;由表5可知:不同品種、不同生長期和不同部位的柑橘作物中成分質(zhì)量分數(shù)各不相同。

        盡管如此,通過上述方法一次測定且同時獲得上述5種成分的含量是非常方便的。此前,人們或分為2~3次分別測量5種物質(zhì),或僅測其中的3~4種,試驗所建立的HPLC方法可方便地同時測得其含量,為測定柑橘水果中類黃酮和苦味物質(zhì)節(jié)約大量的成本與時間。

        表3 5種成分的重復(fù)進樣結(jié)果

        表4 5種成分的加樣回收率?

        1. 蕓香柚皮苷 2. 柚皮苷 3. 橙皮苷 4. 新橙皮苷 5. 檸檬苦素圖4 柚子幼果在283 nm和220 nm處的色譜圖Figure 4 Chromatograms of young pomelo sample solution at 220 nm and 283 nm

        1. 蕓香柚皮苷 2. 柚皮苷 3. 橙皮苷 4. 新橙皮苷 5. 檸檬苦素圖5 柚子汁在283 nm和220 nm處的色譜圖Figure 5 Chromatograms of young pomelo sample solution at 283 nm and 220 nm

        表5 不同柚子品種與部位的5種成分質(zhì)量分數(shù)

        3 結(jié)論

        試驗建立的高效液相色譜法在20 min內(nèi),利用PDA檢測器在283 nm與220 nm分別完成了對柚子幼果及柚子果汁中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素5種關(guān)鍵的黃酮類和苦味物質(zhì)的同時定量測定,測得柚子幼果中5種成分的質(zhì)量分數(shù)分別為8.49%,8.05%,1.30%,1.31%,1.46%,柚子果汁中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素的質(zhì)量分數(shù)分別為1.41%,2.63%,0.23%,0.16%,0.78%。但最終確定的方法中,新橙皮苷與檸檬苦素峰[圖2(g)]之間的時間間隔仍然較長,后續(xù)可使用不同流動相組分或洗脫方法予以減少。

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