張俊華，李富榮，楊文貴，王進云，金哲宇，馬瑛龍，任 崢，樸文花

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疫情已成為全球關(guān)注的焦點，早期診斷并及時管控是阻止疫情進一步播散和控制新感染線索的關(guān)鍵[1]，因此，及時篩查并確診感染仍是當前實驗室檢測面臨的首要任務(wù)。核酸檢測陽性是疑似患者確診的“金標準”，但其對實驗場地及操作人員均有較高要求，而且檢測結(jié)果易受標本質(zhì)量、病毒感染部位及表達量等眾多因素影響，新冠病毒血清學抗體檢測可在一定程度上彌補核酸檢測對于檢測條件要求較高的局限性[2-3]，對于疫情防控來說，可為核酸檢測提供一個重要的補充協(xié)同手段，在《新型冠狀病毒肺炎診療方案(第七版)》中，抗體檢測已經(jīng)被納入確診方法之一[ 4]。本實驗旨在補充研究血清學抗體檢測在新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的方法學差異，分別利用血清學抗體的膠體金免疫層析法(GICA)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、化學發(fā)光法( CLIA)檢測新型冠狀病毒血清學特異性抗體，為實驗室檢測新型冠狀病毒肺炎提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料：本研究采集了寧夏回族自治區(qū)21例核酸檢測陽性的COVID-19確診病例(2020年2月10日-3月12日收治)26份血清標本，21個病例中有5個病例采集了不同時期的雙份血清標本，血清收集時間最早為發(fā)病后第22天，最晚為發(fā)病后第53天。此外還補充檢測了16例康復(fù)隨訪患者，病例年齡范圍為7～67歲，平均年齡35歲，其中男性7例，女性9例。陰性血清標本來自寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院及寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院篩查的排除新冠肺炎患者為對照組，共計30份，確診及對照標本參照《新型冠狀病毒肺炎診療方案(第七版)》。

1.2 試劑與方法

1.2 1 試劑：①膠體金免疫層析法檢測試劑：A為國產(chǎn)某品牌新型冠狀病毒(2019-nCoV)抗體膠體金法檢測試劑盒，包括兩類檢測試劑，其中A1試劑為新型冠狀病毒(2019-nCoV)IgM抗體膠體金法檢測試劑,批號為20200205，有效期至2020/11/04；A2試劑為新型冠狀病毒(2019-nCoV)抗體IgG膠體金檢測試劑,批號為20200208，有效期至2020/11/09。B為國產(chǎn)某品牌新型冠狀病毒(2019-nCoV)抗體(IgG/IgM)膠體金法檢測試劑，批號為W19500304,有效期至2020/10/04；C為國產(chǎn)某品牌新型冠狀病毒(2019-nCoV)抗體(IgG/IgM)膠體金法檢測試劑，批號為2005120410，有效期至2020/11/02。②酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑：D為國產(chǎn)某品牌新型冠狀病毒(2019-nCoV)(IgG/IgM)抗體酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑，批號為20200205，有效期至2021/2/20。③化學發(fā)光法檢測試劑：E為新型冠狀病毒(2019-nCoV)抗體測定試劑盒(化學發(fā)光微粒子免疫檢測法)，注冊證號20203400198，批號20200521，有效期至2020/11/4。不同試劑基本特征見表1。

表1 不同檢測試劑性能特征

1.2.2 膠體金免疫層析法：嚴格按照試劑使用說明書操作，肉眼觀察顯示結(jié)果判定。判讀陽性：在檢測區(qū)及質(zhì)控區(qū)各出現(xiàn) 1 條反應(yīng)線；判讀陰性：僅在質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)1條反應(yīng)線；判讀無效：質(zhì)控區(qū)無反應(yīng)線出現(xiàn)，或僅在檢測區(qū)出現(xiàn)1條反應(yīng)線，表明檢測無效。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法：操作嚴格按試劑盒操作說明書進行，設(shè)定酶標儀于450/630 nm處用空白孔調(diào)零，測定各孔吸光光度(OD)值。結(jié)果判定：臨界值(cut off)=陰性對照平均OD值×2.1(陰性對照孔值低于0.05者按0.05計算)，陰性對照孔OD值<0.10，陽性對照孔OD值>0.80，否則試驗無效。陽性判定：樣品OD值≥臨界值(cut off)者為2019-nCov抗體陽性；樣品OD值<臨界值(cut off)者為2019-nCov抗體陰性。

1.2.4 化學發(fā)光微粒子免疫檢測法：運用化學發(fā)光微粒子免疫檢測法測定，加入預(yù)激發(fā)液與激發(fā)液后測量產(chǎn)生的化學發(fā)光反應(yīng)信號，以相對發(fā)光單位(RLU)表示。樣本中存在的2019-nCoV抗體量與系統(tǒng)檢測的RLU成正比。樣本S/CO≥1.0時，視為對2019-nCoV抗體呈反應(yīng)性。實驗操作步驟均按說明書嚴格進行操作。

1.3 主要儀器：酶標儀(鄭州安圖全自動酶標分析儀)。

1.4 統(tǒng)計學方法：采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，不同檢測方法診斷的準確性采用敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、漏診率、誤診率、約登指數(shù)進行描述。

2 結(jié)果

2.1 不同試劑盒檢測血清學抗體結(jié)果：采用不同檢測方法的六種試劑盒(A1、A2、B、C、D、E)檢測56例血清樣本，其中四種GICA法檢測試劑(A1、A2、B、C)敏感性為69.2%～80.7%；特異性為96.7%～100.0%；陽性預(yù)測值95.2%～100.0%，陰性預(yù)測值為78.9%～85.7%；漏診率和誤診率分別為19.2%～30.8%和0.0%～3.3%，約登指數(shù)為0.69～0.81；ELISA及CLIA檢測試劑(D、E)敏感性分別為92.3%和96.2%，特異性及陽性預(yù)測值可達到100.0%，陰性預(yù)測值分別是93.8%和96.8%，漏診率分別為7.7%和3.9%，誤診率為0.0%，約登指數(shù)分別為0.92和0.96。不同試劑盒檢測能力評價表，見表2。

表2 不同試劑盒檢測血清學抗體的能力評價

2.2 16例康復(fù)期患者血清IgM和IgG抗體陽性率比較：16例血清標本中16號、18號標本IgM和IgG抗體均為陰性，13號、22號、25號、26號標本檢測結(jié)果為IgM(+)IgG(-)，19號標本檢測結(jié)果為IgM(-)IgG(+)，其余9例標本(距發(fā)病時間26～37 d)檢測IgM和IgG抗體結(jié)果均為陽性，見表3。

2.3 三種檢測方法靈敏度比較：CLIA檢測血清按1∶512倍稀釋時，檢測仍為陽性(1號、3號、4號、5號標本)，而ELISA檢測陽性最大稀釋倍數(shù)為1∶256(5號標本)，GICA檢測陽性最大稀釋倍數(shù)為1∶128(2號標本)，5例標本陽性檢出率隨樣本稀釋滴度的增加而降低，化學發(fā)光法檢測2019-nCoV總抗體靈敏度高于其他兩種方法，酶聯(lián)免疫吸附法次之，見表4。

表3 16例康復(fù)期患者血清IgM和IgG抗體陽性率比較

表4 3種方法學檢測試劑C/D/E對5例陽性標本梯度稀釋結(jié)果

3 討論

核酸檢測作為COVID-19確診標準，具有靈敏度高、特異度好、可早期診斷等優(yōu)點[5]，但相關(guān)研究表明，新型冠狀病毒核酸檢測對于確診陽性病例的檢出率僅為30%～50%[6]，血清特異性抗體檢測可以滿足對疑似病例快速篩查的要求，是實驗室診斷的重要手段?？贵w的檢測對于病毒確診及感染時間、評估病毒的感染階段并預(yù)測疾病轉(zhuǎn)歸具有重要意義[7-8]。

本研究分別利用GICA、ELISA、CLIA三種檢測方法對2019-nCoV病毒血清特異性抗體進行檢測，比較6種試劑盒對COVID 19 患者的抗體陽性檢出率差異，其中ELISA與CLIA診斷試劑準確性較高。在GICA檢測試劑中，總抗體檢測的約登指數(shù)高于單獨檢測IgM和 IgG，在各項評價指標中的結(jié)果高于IgM和IgG檢測試劑盒，在臨床使用GICA試劑的過程中，建議使用總抗體檢測試劑或?qū)gG與IgM抗體聯(lián)合檢測，以保證靈敏度和特異性，降低因假陽性和假陰性帶來的漏診和誤診[9]。

同時，在本次實驗中發(fā)現(xiàn)金標法試劑檢測靈敏度低于其他檢測方法，會有漏檢和誤檢現(xiàn)象，建議多種檢測方法聯(lián)合使用。膠體金法檢測試劑中，針對新冠病毒抗體IgM和IgG，聯(lián)合檢測相比抗體IgM的單項檢測更具優(yōu)勢，可對新冠肺炎患者疾病發(fā)展過程的不同階段進行全覆蓋，從不同維度完善對新冠病毒肺炎疑似患者的輔助診斷，在一定程度上提高患者的陽性檢出率[10]。

通常病原體感染機體后產(chǎn)生的特異性IgG抗體晚于IgM抗體，新冠病毒感染者特異性IgG抗體在發(fā)病后第1周的陽性率較低(3.7%～42.9%)，第2周的陽性率逐漸上升到43.5%～76.0%[11]。但也有研究報告，特異性IgG抗體陽性率在第2周能達到90.0%以上。新冠病毒特異性IgG抗體水平在發(fā)病后第3～4周迅速上升并達到峰值，陽性率為80.0%～100.0%，在第5～7周特異性IgG抗體陽性率可維持在100.0%[12-13]。GICA相同品牌試劑盒分別檢測16例康復(fù)隨訪患者IgM和IgG抗體，病例距發(fā)病時間23～37 d (3～5周)，2019-nCoV IgM抗體有14例陽性，2例陰性患者不排除IgM抗體水平下降所致，2019-nCoV IgG抗體檢測10例陽性，4例陰性，分析抗體檢測差異和假陰性可能與試劑盒本身檢測差異有關(guān)，也可能與病毒的感染機制有關(guān)，有待進一步研究。

通過5例陽性血清的梯度稀釋實驗，CLIA結(jié)合了高靈敏的化學發(fā)光測定方法與高特異的抗原抗體反應(yīng)，其敏感性上高于ELISA及GICA兩種方法。此外，不同新冠患者抗體滴度水平差異表明個體感染病毒狀況不同或機體免疫應(yīng)答存在差異，在康復(fù)患者血漿用于治療前進行抗體滴度的檢測以保證療效是非常必要的。

本研究僅為初步探索，客觀原因?qū)е螺^少的實驗標本量使得納入病例數(shù)較少，且樣本連續(xù)性不足，研究采用的部分膠體金法和ELISA法試劑均為用于科學研究的試劑，而不是用于病例診斷，因此可能存在試劑質(zhì)量問題導(dǎo)致假陰性或假陽性。同時，新型冠狀病毒對于其血清中抗體產(chǎn)生時間及其消長規(guī)律還處于探索研究階段，在疫情防控過程中，仍然需要大量的抗體檢測數(shù)據(jù)以推動病毒的流行病學調(diào)查。因此血清學抗體檢測暫時不能作為新冠肺炎確診和排除的唯一依據(jù)，國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心張瑞等從新型冠狀病毒特異抗體檢測的假陽性角度出發(fā)，認為特異性IgM/IgG抗體檢測不適用復(fù)工等一般人群的篩查[14]，血清學抗體檢測可以作為核酸檢測陰性疑似病例的補充檢測指標，通過核酸、抗體檢測聯(lián)合應(yīng)用，可以縮短檢測窗口期，提高陽性檢出率，有利于病例的發(fā)現(xiàn)、診斷以及疫情的防控。