李 芳， 余夢(mèng)瑤， 江 南， 賀黎銘， 姚 珂， 羅 霞

(四川省中醫(yī)藥科學(xué)院菌類藥材研究所， 菌類藥材系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)室， 中藥材品質(zhì)及創(chuàng)新中藥研究四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 成都 610041)

1 引 言

靈芝是我國(guó)傳統(tǒng)的補(bǔ)益中藥，具有扶正固本的作用，現(xiàn)代藥理研究表明靈芝具有抑制腫瘤[1]和免疫調(diào)節(jié)作用[2]，近年來(lái)常被用于腫瘤放化療的輔助治療.靈芝多糖和三萜是其主要藥效成分，多糖對(duì)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞無(wú)直接抑制作用，其抑瘤作用與免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)：促進(jìn)樹(shù)突細(xì)胞成熟和分化[3]，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能[4]，促進(jìn)自然殺傷細(xì)胞活性[5]等；而靈芝三萜類成分主要通過(guò)直接毒殺腫瘤細(xì)胞而發(fā)揮抗腫瘤作用[6]，二者抗腫瘤作用沒(méi)有直接的可比性，但適宜的配伍能有效提高抗腫瘤作用[7].

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)是以CD4+CD25+FOXP3+為特征的T淋巴細(xì)胞亞群，是體內(nèi)重要的免疫負(fù)調(diào)控細(xì)胞，是腫瘤免疫逃逸的關(guān)鍵因素[8].研究發(fā)現(xiàn)靈芝孢子多糖能有效抑制Treg細(xì)胞功能.但是靈芝子實(shí)體三萜、多糖配伍是否能有效提高對(duì)Treg細(xì)胞功能的抑制作用，目前尚無(wú)相關(guān)的研究報(bào)道.本研究利用前期研究獲得的最佳抑瘤配伍劑量[7]，開(kāi)展該方面的深入研究，有利于進(jìn)一步闡釋靈芝抗腫瘤的作用機(jī)制.

2 材料與方法

2.1 主要試劑

二甲亞砜(DMSO)、透明質(zhì)酸酶、DNA酶Ⅰ、膠原酶Ⅳ、牛血清白蛋白(BSA)，購(gòu)自sigma公司.小鼠腫瘤浸潤(rùn)組織淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司.CD3-PerCP-Cy5.5、CD4-FITC、CD25-APC、foxp3-PE流式抗體購(gòu)自BD生物科技公司.Foxp3染色固定透膜液購(gòu)自invitrogen公司.UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒，購(gòu)自生工生物工程股份有限公司.瓊脂糖B、4S Red Plus 核酸染色劑、2X SG Fast qPCR Master Mix購(gòu)自BBI公司；GeneRuler DNA Ladder Mix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自Thermo Scientific公司.ELISA試劑盒均購(gòu)自上海茁彩生物科技有限公司；兔抗FOXP3多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)R&D公司.多聚甲醛購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.蘇木素購(gòu)自北京百靈威科技有限公司.中性樹(shù)膠購(gòu)自中國(guó)上海懿洋儀器有限公司.其余常用化學(xué)試劑購(gòu)自成都科龍化工試劑廠.

2.2 方 法

2.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模和分組 Km(昆明種)小鼠，SPF級(jí)，雄性，體重18～22 g，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)證號(hào)：SCXK(川)2013-19，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房.靈芝多糖和三萜從赤芝子實(shí)體中提取獲得.H22細(xì)胞株購(gòu)自中科院細(xì)胞所，于小鼠腹腔內(nèi)傳代保存.每只小鼠右側(cè)腋窩皮下準(zhǔn)確接種H22細(xì)胞 2×106個(gè)，接種次日，小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、三萜組、多糖組和配伍組，每組20只，分別以溶劑、靈芝三萜(90 mg/kg)、多糖(43 mg/kg)及多糖三萜(90 mg/kg+43 mg/kg)配伍腹腔注射給藥，連續(xù)給藥15 d，從第3 d起每2 d檢測(cè)一次腫瘤直徑，末次給藥結(jié)束后頸椎脫臼處死小鼠，分離腋下腫瘤稱重，計(jì)算抑瘤率和體積(0.52×長(zhǎng)×寬2)，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線.

2.2.2 靈芝多糖和三萜的提取 按照《中國(guó)藥典2015版》中靈芝多糖和三萜提取和含量測(cè)定方法操作[9]，采用Sevag法除去提取物中的蛋白質(zhì)后對(duì)靈芝多糖和三萜含量進(jìn)行測(cè)定。

2.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Treg細(xì)胞數(shù)量 解剖小鼠腫瘤組織，用RPMI1640培養(yǎng)基洗去血污.稱取1 g左右的腫瘤組織，加入4 mL酶解液，用眼科剪剪碎至2～5 mm3大小，置37 ℃酶解2 h.取酶解液，以200目不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾，除去未酶解完全的組織塊.取玻璃試管，加入5 mL小鼠腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞分離液，離心后獲得淋巴細(xì)胞.洗滌淋巴細(xì)胞兩次后加入CD3、CD4、CD25抗體室溫避光孵育30 min后離心5 min，棄上清.加入1 mL染色緩沖液，重懸細(xì)胞，400～600 g離心5 min，棄上清.完成表面抗原染色后的細(xì)胞，再加入1 mL Foxp3染色固定透膜液，室溫孵育1 h.加入透膜緩沖液重懸細(xì)胞，離心后棄上清，加入FOXP3抗體染色后上流式細(xì)胞儀檢測(cè).

2.2.4 熒光定量PCR檢測(cè)mRNA水平 按15～25 mg小鼠腫瘤組織加入0.5 mL Trizol用勻漿器勻漿處理，獲得的勻漿液按柱式 Trizol 總RNA抽提試劑盒操作步驟進(jìn)行總RNA提取，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA.PCR反應(yīng)體系：2×SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL、正反引物各0.4 μL、cDNA模板2 μL、ddH2O 7.2 μL.PCR循環(huán)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán).為保證結(jié)果的精確性，重復(fù)三次每個(gè)反應(yīng).

引物序列:

GAPDH-F：5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，

GAPDH-R：5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3′；

CCL22-F：5′-TCTCGTCCTTCTTGCTGTGG-3′，

CCL22-R：5′-GCAGAGGGTGACGGATGTAGT-3′；

CCR4-F：5′-CATCTCGGATTTGCTGTTCG-3′，

CCR4-R：5′-CTGGTGATGACGCCATAGGT-3′；

FOXP3-F：5′-TGGTTTACTCGCATGTTCGC-3′，

FOXP3-R:5′-AACTCAAATTCATCTACGGTCCA-3′.

2.2.5 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子含量 將小鼠腫瘤組織研磨成細(xì)胞懸液，離心后取上清，然后按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行具體操作.用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，計(jì)算樣品濃度.

2.2.6 免疫組化染色法檢測(cè)腫瘤組織中FOXP3蛋白的表達(dá) 處死小鼠，解剖下腫瘤組織，放入4%多聚甲醛溶液中，固定48 h，常規(guī)梯度酒精脫水，石蠟包埋，制備組織切片.脫蠟后的切片放入染色缸，3%甲醇雙氧水室溫10 min；PBS洗3次，每次5 min；將切片浸入0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)，微波爐中高火加熱至沸騰后斷電，間隔5 min后，反復(fù)1次，冷卻后，PBS洗2次，每次5 min；滴加山羊血清封閉液，室溫20 min；滴加一抗，4 ℃過(guò)夜；滴加生物素化二抗，37 ℃30 min；PBS水洗3次，每次5 min；DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒，混勻試劑后滴加到切片上，室溫顯色，鏡下控制反映時(shí)間2 min，蒸餾水洗滌；蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片.采用顯微成像系統(tǒng)拍照后，以Image pro plus6.0軟件對(duì)陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域進(jìn)行累積光密度(IOD)分析.

3 結(jié)果與分析

3.1 靈芝多糖和三萜的含量測(cè)定

3.1.1 靈芝多糖含量 按中國(guó)藥典中硫酸蒽酮法檢測(cè)，靈芝多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果如下：

圖1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Polysaccharide standard curve

根據(jù)樣品吸光度由公式y(tǒng)=8.6905x+0.2176計(jì)算出提取物樣品中多糖含量為481.90 mg/g.

3.1.2 靈芝三萜含量 按中國(guó)藥典中方法檢測(cè)，靈芝三萜標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果如下：

根據(jù)樣品吸光度由公式y(tǒng)=12.634x+0.0106計(jì)算出提取物中三萜含量為434.40 mg/g.

圖2 三萜標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Triterpene standard curve

3.2 H22荷瘤小鼠瘤體生長(zhǎng)情況

小鼠處死后立即解剖下腫瘤組織，稱重，各組小鼠瘤重及腫瘤體積分別見(jiàn)表1和圖3.與對(duì)照組相比，各給藥組解剖下的小鼠瘤重都明顯更輕，其中靈芝多糖組具有顯著性差異(P<0.05)，配伍組具有極顯著性差異(P<0.01)；配伍組抑瘤率明顯高于多糖組和三萜組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01).各給藥組腫瘤體積均較對(duì)照組減小(P<0.05，P<0.01)，配伍組腫瘤體積明顯小于多糖組和三萜組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖 1，P<0.05，P<0.01).表明靈芝多糖和三萜均能抑制小鼠H22瘤體生長(zhǎng)，二者配伍給藥能增強(qiáng)抑瘤作用.

表1 小鼠瘤體重量及抑瘤率

圖3 腫瘤生長(zhǎng)曲線圖

3.3 靈芝對(duì)小鼠腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞數(shù)量的影響

經(jīng)流式細(xì)胞法測(cè)定小鼠腫瘤組織中Treg細(xì)胞(CD4+CD25+foxp3+)在CD4+細(xì)胞中的比例，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表 2所示，流式結(jié)果圖見(jiàn)圖4.與對(duì)照組相比，各給藥組小鼠腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞比例均有所降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；配伍組Treg細(xì)胞比例明顯低于三萜組和多糖組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).結(jié)果表明，靈芝多糖和三萜均能降低腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞比例，二者配伍給藥具有協(xié)同效應(yīng).

表2 小鼠腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞比例

3.4 Treg細(xì)胞趨化相關(guān)關(guān)鍵基因的RT-PCR檢測(cè)

經(jīng)檢測(cè)小鼠腫瘤微環(huán)境中Treg 細(xì)胞趨化相關(guān)關(guān)鍵基因：趨化因子CCL22及其受體CCR4和FOXP3在腫瘤組織中的表達(dá)，結(jié)果如圖5所示.與對(duì)照組相比，靈芝三萜組和多糖組中相關(guān)基因的表達(dá)無(wú)明顯變化，配伍組相關(guān)基因的表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，配伍組的CCL22、CCR4和FOXP3基因表達(dá)水平都明顯低于三萜組和多糖組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).結(jié)果表明，靈芝三萜、多糖配伍給藥能降低Treg 細(xì)胞趨化相關(guān)關(guān)鍵基因的表達(dá)，減少Treg細(xì)胞向腫瘤微環(huán)境中趨化.

圖4 小鼠腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞比例流式圖Fig.4 FACS analyses of Treg cell ratio in mouse tumor microenvironment

圖5 腫瘤微環(huán)境中基因表達(dá)分析圖

3.5 腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子水平

經(jīng)檢測(cè)腫瘤組織中細(xì)胞因子IL-10、TGF-β1和IL-2含量，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖6所示.與對(duì)照組相比，各給藥組的IL-10和TGF-β1的含量均有所降低，其中多糖組和配伍組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；配伍組IL-10和TGF-β1水平明顯低于三萜組和多糖組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).與對(duì)照組相比，各給藥組的IL-2的含量均有所降低，多糖組和配伍組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，配伍組IL-2水平明顯高于三萜組和多糖組(P<0.05).結(jié)果表明，靈芝三萜和多糖均能降低IL-10和TGF-β1水平，同時(shí)增加IL-2水平.

圖6 小鼠腫瘤組織中細(xì)胞因子含量

3.6 腫瘤微環(huán)境中FOXP3蛋白表達(dá)水平

各組腫瘤組織中FOXP3陰性細(xì)胞呈藍(lán)色，底物呈白色，陽(yáng)性細(xì)胞呈黃色或棕黃色，F(xiàn)OXP3陽(yáng)性產(chǎn)物主要分布在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞間質(zhì).與對(duì)照組相比，各給藥組FOXP3均呈現(xiàn)較弱的表達(dá)水平(圖7).

圖7 小鼠腫瘤微環(huán)境中FOXP3蛋白表達(dá)Fig.7 Expression of FOXP3 protein in mouse tumor microenvironment

平均光密度統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表 3)顯示，與對(duì)照組相比，各給藥組小鼠腫瘤組織FOXP3蛋白含量均有降低，其中三萜組和配伍組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；配伍組小鼠腫瘤組織FOXP3蛋白含量明顯低于三萜組和多糖組，其中多糖組與配伍組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).結(jié)果表明，靈芝三萜和多糖均能降低小鼠腫瘤組織中FOXP3蛋白的表達(dá)，二者配伍給藥具有協(xié)同效果.

表3 小鼠腫瘤組織FoxP3平均光密度統(tǒng)計(jì)結(jié)果

靈芝多糖類制劑近年來(lái)常被用于臨床腫瘤患者放化療的輔助治療，在提高患者對(duì)放化療的耐受性、增強(qiáng)免疫、減輕副反應(yīng)等方面的效果都已被臨床初步證實(shí)[10-11]，而靈芝三萜類成分目前尚無(wú)臨床應(yīng)用報(bào)道.靈芝多糖、三萜配伍使用能顯著提高抑瘤效果，目前已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)[12]，在獲得靈芝多糖、三萜抗腫瘤最佳配伍劑量的基礎(chǔ)上，開(kāi)展二者配伍使用的內(nèi)在機(jī)制研究，可為靈芝輔助治療腫瘤提供理論依據(jù)與指導(dǎo).

腫瘤微環(huán)境(TME)是支持腫瘤產(chǎn)生、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的復(fù)雜腫瘤生態(tài)系統(tǒng)，包含腫瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞、細(xì)胞間質(zhì)、微血管以及浸潤(rùn)其中的生物分子[13].近年在TME中發(fā)現(xiàn)了新的靶點(diǎn)，可以幫助指導(dǎo)和改善各種癌癥治療的作用，特別是通過(guò)增強(qiáng)宿主抗腫瘤免疫反應(yīng)而起作用的免疫療法[14]，是近年免疫治療研究熱點(diǎn).Treg細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中一類免疫負(fù)調(diào)控細(xì)胞，主要是CD4+CD25+FOXP3+細(xì)胞，原本在胸腺、骨髓、淋巴結(jié)以及外周血中自然產(chǎn)生，經(jīng)趨化因子CCL22與其受體CCR4的結(jié)合，將其趨化至腫瘤微環(huán)境中[15].Treg細(xì)胞能夠直接接觸抑制靶細(xì)胞活性，通過(guò)分泌IL-10及TGF-β等細(xì)胞因子抑制Th細(xì)胞的增殖分化及其分泌細(xì)胞因子，抑制效應(yīng)細(xì)胞的免疫應(yīng)答，是腫瘤免疫逃逸的關(guān)鍵因素[16].

Sun等[17]的體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，靈芝孢子多糖可使B16F10黑素瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中的IL-10及TGF-β生成顯著減少，有效抑制Treg細(xì)胞活性.Li等[18]研究表明，靈芝多糖能顯著抑制肝癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)，抑制腫瘤微環(huán)境中FOXP3的表達(dá)，減少Treg細(xì)胞向腫瘤組織中募集，消除Treg 細(xì)胞的免疫抑制，使腫瘤微環(huán)境中免疫平衡偏向效應(yīng)性T細(xì)胞.本研究發(fā)現(xiàn)靈芝子實(shí)體多糖同樣能減少IL-10、TGF-β生成及FOXP3的表達(dá)，Treg細(xì)胞向腫瘤組織中募集，三萜本身無(wú)此作用，但通過(guò)三萜、多糖配伍使用后作用效果增強(qiáng)，因此，三萜能協(xié)同增強(qiáng)多糖對(duì)腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞功能抑制效應(yīng).

靈芝三萜能快速增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫活性，促進(jìn)肺癌小鼠機(jī)體產(chǎn)生白介素-2(IL-2)，并提高自然殺傷(NK)細(xì)胞的免疫活性[19].Treg細(xì)胞主要表面抗原CD25，是白介素2受體α鏈(IL-2Rα)，能競(jìng)爭(zhēng)性與IL-2結(jié)合，使腫瘤微環(huán)境中效應(yīng)T細(xì)胞因?yàn)槿狈L-2受到抑制[20].本研究發(fā)現(xiàn)靈芝三萜及配伍均提高了腫瘤微環(huán)境中IL-2水平，三萜可能通過(guò)增加IL-2的分泌或解除Treg細(xì)胞引起的IL-2競(jìng)爭(zhēng)，對(duì)多糖抑制Treg細(xì)胞功效起到協(xié)同作用.

綜上所述，本研究從腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞數(shù)量、特異蛋白表達(dá)、趨化因子mRNA水平及細(xì)胞因子水平等方面分別考察靈芝多糖、三萜對(duì)Treg細(xì)胞功能的影響研究，確認(rèn)了靈芝三萜、多糖對(duì)腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞功能的抑制作用，有利于促進(jìn)機(jī)體抗腫瘤免疫.