羅良淵，劉 趣，徐文芬，陳胤睿，鄭亮亮，楊 港，韋華蘭

(貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

白茅根為常用中藥，又名蘭根、地筋、茅草根、甜草根等，來源于禾本科植物白茅ImperatacylindricaBeauv.var.major(Nees) C.E.Hubb.的干燥根莖，為2015年版《中國藥典》一部收載品種。白茅根飲片有白茅根和茅根炭兩種規(guī)格，具有涼血止血、清熱利尿的功效，臨床用于治療血熱吐血、衄血、尿血、熱病煩渴、濕熱黃疸、水腫尿少、熱淋澀痛[1]。早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載茅根味甘，性寒，主勞傷虛羸，補(bǔ)中益氣，除瘀血，血閉寒熱，利小便[2]，其用藥歷史悠久，療效可靠。白茅根亦可鮮用，與玉米須同食，取其清熱利尿之效。

白茅根的現(xiàn)代研究主要集中在化學(xué)成分、藥理作用、質(zhì)量控制等方面。白茅根化學(xué)成分主要有綠原酸、棕櫚酸、反式對羥基桂皮酸等有機(jī)酸類[3-5]，多糖、葡萄糖、果糖和木糖等糖類[6]。此外，該藥材中還含有三萜類、甾醇類等[7-9]化合物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明白茅根具有止血、利尿降壓、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、降血糖降血脂等[10-15]藥理作用，臨床用于治療肝炎、急性腎炎和血尿等疾病[16-19]。在質(zhì)量控制方面，2015年版《中國藥典》一部收載的白茅根質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中包括來源、性狀、顯微鑒別、薄層鑒別、水分、灰分和浸出物含量的測定，這對于成分復(fù)雜的中藥來說難以全面反映其真實質(zhì)量。關(guān)于白茅根質(zhì)量控制方面的文獻(xiàn)報道有單個及總類成分含量測定、指紋圖譜等，尤以含量測定的報道居多，如采用高效液相色譜法測定白茅根中聯(lián)苯雙酯、4，7-二甲氧基-5-甲基-香豆素等含量[20-21]；采用紫外分光光度法測定白茅根中總酚酸、多糖的含量等[22-23]；張素紅、趙燕燕等[23-24]采用HPLC法進(jìn)行了白茅根藥材、氯仿提取物指紋圖譜研究；曹雨誕等[25]采用HPLC法研究了白茅根炒炭前后5-羥甲基糠醛的含量變化。這些研究取得的進(jìn)展在一定程度上為白茅根藥材質(zhì)量評價提供了參考，但是對于白茅根鮮藥材及其炮制前后整體化學(xué)成分變化的研究鮮有報道。鑒于此，本文采用高效液相色譜法建立鮮白茅根、白茅根和茅根炭的化學(xué)指紋圖譜測定方法，構(gòu)建其不同炮制品的指紋圖譜，并對其指紋圖譜進(jìn)行對比分析研究，旨在為白茅根藥材及飲片的質(zhì)量控制及評價提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Thermo Ultimate-3000型高效液相色譜儀(美國賽默飛公司)；AG1353型電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；DK-98Ⅱ水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 藥材

實驗樣品由課題組采自貴州主要分布區(qū)及山東購買，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定為禾本科植物白茅ImperatacylindricaBeauv.var.major(Nees) C.E.Hubb.的干燥根莖，除去須根和膜質(zhì)葉鞘，采取相應(yīng)方法處理，備用。藥材來源信息見表1。

表1 樣品信息

1.3 試劑

綠原酸對照品(HPLC≥99.39%，批號MUST-18030620)；五羥甲基糠醛對照品(HPLC≥98%，批號BGY-000589)；乙腈、甲醇為色譜純(美國天地有限公司)；磷酸、甲醇、乙醇等均為分析純，水為重蒸餾水。

1.4 樣品處理

1.4.1 鮮白茅根 將采集的白茅根莖洗凈，除去須根和膜質(zhì)葉鞘，微潤切段，放入冰箱冷藏室備用。

1.4.2 白茅根 將采集的白茅根莖洗凈，除去須根和膜質(zhì)葉鞘，微潤切段，稱重并記錄。置于55 ℃烘箱中干燥，水分不超過12.0%，稱重并記錄，計算各批次茅根干燥減失的水分含量(干燥減失的水分含量=(鮮白茅根質(zhì)量-干燥后白茅根質(zhì)量)/鮮白茅根質(zhì)量×100%)，粉碎過三號篩備用。

1.4.3 茅根炭 取“1.4.2”項下白茅根適量，參照2015年版《中國藥典》四部炒炭法(炮制通則0213)，中火炒至表面焦褐色，內(nèi)部焦黃色，放涼，粉碎過三號篩備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備

2.1.1 白茅根 稱取1.0 g白茅根藥材粉末，精密稱定，精密量取20 mL 70%乙醇，水浴回流3 h，恢復(fù)至室溫，用相應(yīng)溶劑補(bǔ)足減失的重量，過濾，濾液至水浴鍋上揮干，用70%乙醇定容至5 mL容量瓶中，0.45 μm微孔濾膜濾過即得供試品溶液。

2.1.2 鮮白茅根 根據(jù)相應(yīng)批次茅根的干燥減失的水分含量，計算出1.0 g干品所對應(yīng)的鮮品質(zhì)量，稱量，用研缽研碎，轉(zhuǎn)移至50 mL的錐形瓶中，按照“2.1”項下方法制備供試品溶液。

2.1.3 茅根炭 按照“2.1.1”項下方法制備。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取綠原酸對照品適量，加70%乙醇使溶解并得濃度為20.0 μg·mL-1的綠原酸對照品溶液，備用。

精密稱取5-羥甲基糠醛對照品適量，加70%乙醇使溶解并得濃度為60.0 μg·mL-1的5-羥甲基糠醛對照品溶液，備用。

2.3 HPLC色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：乙腈-0.05%磷酸水溶液，流速：1.0 mL·min-1，柱溫：25 ℃，檢測波長：280 nm，進(jìn)樣量：10 μL。梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序

2.4 方法學(xué)考察試驗

2.4.1 精密度試驗 取S5白茅根樣品1份，按照“2.1”項下方法制備供試品溶液，按照“2.3”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，采集并記錄色譜圖，并導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004 A版)》(以下簡稱“相似度軟件”)進(jìn)行相似度評價，結(jié)果6次進(jìn)樣測得的指紋圖譜相似度均大于0.9，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜測定的要求。

2.4.2 重復(fù)性試驗 取S5白茅根樣品，按照“2.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.3”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。經(jīng)過相似度軟件評價，6份樣品測定的指紋圖譜相似度均大于0.9，表明該方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜測定要求。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 按照“2.1”項下方法制備S5白茅根供試品溶液1份，分別于0、4、8、12、24 h，按照“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。經(jīng)過相似度軟件評價，不同時間進(jìn)樣測得的指紋圖譜相似度均大于0.9，表明該供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 完整性試驗 按照“2.1”項下方法制備S5白茅根供試品溶液1份，按照“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，以流動相梯度最終濃度繼續(xù)洗脫至170 min，采集色譜圖，見圖1。結(jié)果在采集110 min以后基本無色譜峰出現(xiàn)，表明采集110 min即可完整記錄白茅根的化學(xué)成分信息。

圖1 完整性試驗HPLC色譜

2.5 白茅根及炮制品指紋圖譜建立

精密稱取10個批次的鮮白茅根、白茅根與茅根炭藥材，按照“2.1”項下方法，制備供試品溶液，按照“2.3”項下色譜條件依法測定，將記錄的色譜圖分別導(dǎo)入相似度軟件，以每種白茅根樣品的S5為參照譜，采用中位數(shù)法，時間窗寬度為0.5，多點校正，自動匹配，得到3種白茅根樣品的共有模式及對照指紋圖譜，見圖2、圖3、圖4、圖5、圖6、圖7。綜合10個批次的3種白茅根樣品，共標(biāo)定23個共有峰，其中3種白茅根樣品均含有共有峰13，且響應(yīng)值高(茅根炭樣品較低)，基本上達(dá)到基線分離，故選擇13號峰作為參照峰。從圖譜可得，不同產(chǎn)地鮮白茅根和白茅根在化學(xué)成分組成上無明顯變化，但其化學(xué)成分含量有所差異；茅根炭的化學(xué)成分類型及含量與鮮白茅根、白茅根都有明顯差異，其中共有峰6的含量有了極大增加。

圖2 10批鮮白茅根的HPLC疊加指紋圖譜

圖3 10批不同產(chǎn)地鮮白茅根對照指紋圖譜

圖4 10批白茅根的HPLC疊加指紋圖譜

圖5 10批不同產(chǎn)地白茅根對照指紋圖譜

圖6 10批茅根炭的HPLC疊加指紋圖譜

圖7 10批不同產(chǎn)地茅根炭對照指紋圖譜

2.6 共有峰的指認(rèn)

精密吸取供試品溶液、對照品溶液各10 μL，按照“2.3”項下方法測定。結(jié)果表明供試品溶液色譜圖中共有峰6、共有峰13分別與5-羥甲基糠醛對照品、綠原酸對照品色譜峰的保留時間和UV光譜圖一致，可指認(rèn)共有峰6為5-羥甲基糠醛，共有峰13為綠原酸。

2.7 白茅根指紋圖譜相似度評價及化學(xué)計量學(xué)分析

2.7.1 白茅根指紋圖譜相似度評價 將10個批次的白茅根樣品色譜圖(cdf.格式)全部導(dǎo)入相似度軟件，以白茅根S5樣品色譜圖為參照譜，采用中位數(shù)法，時間窗寬度為0.5，多點校正，自動匹配后得到相似度分析結(jié)果。10個批次的白茅根與對照指紋圖譜的相似度在0.432～0.985之間，其中樣品S1的相似度頗低，可能是其采收季節(jié)不同于其他批次藥材所致。除S1外，另外9個批次的白茅根與對照指紋圖譜的相似度均大于0.82，表明同一采收期不同產(chǎn)地的白茅根藥材在化學(xué)成分上保持一定的穩(wěn)定性，見表3。

a：鮮白茅根；b：白茅根；c：綠原酸對照品；d：茅根炭；e：5-羥甲基糠醛對照品

表3 白茅根樣品的相似度結(jié)果

2.7.2 聚類分析(HCA) 將各個批次的白茅根共有峰峰面積進(jìn)行Z-score標(biāo)準(zhǔn)化處理，導(dǎo)入Origin Pro 2018軟件，采用組平均法進(jìn)行聚類，利用歐氏距離( Euclidean distance)進(jìn)行樣品測定，結(jié)果當(dāng)歐氏距離為7時，樣品被分為兩大類，S6被單獨聚為一類，其他批次聚為一類；當(dāng)歐氏距離為5時，樣品被分為三大類，樣品S5也被單獨聚為一類；當(dāng)歐氏距離為4時，樣品被分為四大類，S7、S8、S10被分為一類，其余的被分為一類。

圖9 10批白茅根樣品聚類分析樹狀圖

2.7.3 主成分分析(PCA) 將白茅根不同炮制品的30批共有峰峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入Origin Pro 2018軟件，以特征值及累計方差貢獻(xiàn)率為依據(jù)進(jìn)行主成分分析，見表4、圖10。以特征值>1為提取標(biāo)準(zhǔn)，得到前4個主成分的累計方差貢獻(xiàn)率為87.73%(>85%)，說明提取的4個主成分可以代表原始色譜峰峰面積87.73%的信息，具有很好的代表性，提示主成分因子1、2、3、4可作為白茅根飲片的評價指標(biāo)。

表4 特征值及方差貢獻(xiàn)率

圖10 主成分分析碎石圖

主成分載荷矩陣可反映各變量對主成分的貢獻(xiàn)大小及方向，根據(jù)主成分載荷矩陣結(jié)果可知，影響白茅根質(zhì)量差異的是多成分聯(lián)合作用的結(jié)果，見表5。第1主成分信息主要來源于色譜峰4、5、8、14、19、22，第2主成分信息主要來源于色譜峰7、10、12、13、11、14，第3主成分、第4主成分主要分別反映色譜峰10、18、20、23和1、11、17、18的化學(xué)信息。主成分1和2的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到67.5%，基本包含了白茅根指紋圖譜的大部分信息，故以第1和2主成分得分建立分值圖，可直觀顯示樣品間的差異，見圖11。由得分圖可得，樣品S5、S6分布均較為離散，S8、S10分布集中在一起，其他批次樣品分布較為集中，此結(jié)果與聚類分析結(jié)果基本一致，兩者相互得以印證。

表5 主成分因子與變量間的相關(guān)系數(shù)

圖11 主成分雙標(biāo)圖(載荷圖+分值圖)

相似度分析、聚類分析和主成分分析的結(jié)果基本一致，10個批次的白茅根樣品間在化學(xué)成分上保持一定的穩(wěn)定性，但由于光照、水分、土壤等生境因素，彼此間也存在著差異，除S1(冬季購買)外，其他9批均為7月份采集，從分析結(jié)果推測樣品在不同季節(jié)采收可能化學(xué)成分差異不大；樣品S3是從山東購買所得，其余均為黔產(chǎn)，分析結(jié)果顯示該批魯產(chǎn)白茅根藥材與黔產(chǎn)藥材差異不大；樣品S5、S9均采自同一個自治縣，但分析結(jié)果顯示兩者差異較大，可能與其生長的小環(huán)境有關(guān)?？梢?，影響白茅根藥材化學(xué)成分的因素很多，這對制定合理科學(xué)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)尤為重要。

2.8 指紋圖譜成分差異分析

2.8.1 指紋圖譜色譜峰對比分析 通過比較鮮白茅根、白茅根、茅根炭的HPLC指紋圖譜，鮮白茅根與白茅根之間的成分類型及含量差異不顯著，而與白茅根與茅根炭相比其化學(xué)成分含量及類型都有一定變化。如圖13示，在茅根炭指紋圖譜中，Ⅰ、Ⅴ區(qū)域所代表的化學(xué)成分的含量均上升，其中Ⅰ區(qū)域中5-羥甲基糠醛含量顯著增加，可能與其是由糖類成分在一定的溫度、濕度、pH值等條件下發(fā)生脫水反應(yīng)轉(zhuǎn)化而來有關(guān)；而Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ區(qū)域所代表的化合物含量在炒炭后均下降，其中Ⅲ區(qū)域所對應(yīng)的化學(xué)成分為綠原酸類，含量下降最為明顯，這可能與綠原酸熱不穩(wěn)定的性質(zhì)有關(guān)，研究結(jié)果與文獻(xiàn)基本一致。

g：白茅根HPLC指紋圖譜；f：茅根炭HPLC指紋圖譜

2.8.2 正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA) 為更好地觀察組間差異，采用監(jiān)督模式識別法對化學(xué)成分差異較大的白茅根和茅根炭進(jìn)行兩組間 OPLS-DA分析，繪制 OPLS-DA模型得分圖，白茅根和茅根炭樣品被分在不同的區(qū)域，詳見圖13。該OPLS-DA模型中，擬合參數(shù)模型和預(yù)測參數(shù)均大于0.5，表明所建模型較穩(wěn)定且預(yù)測能力較強(qiáng)。S-plot圖S曲線的每一個點代表一個化合物，差異性化合物分布在S型曲線的上下兩端。普遍認(rèn)為變量重要性投影值 (VIP值)較大的變量(一般>1)，對分類的貢獻(xiàn)越大[25]。選取位于S-plot圖兩端并且VIP>1的點作為區(qū)分白茅根和茅根炭的差異性化合物，在S-plot圖中，色譜峰6、15、17處于坐標(biāo)圖內(nèi)的最右上方，色譜峰13、9、12、2集中分布坐標(biāo)圖內(nèi)的最左下方，且VIP值均>1，提示這些色譜峰所對應(yīng)的化學(xué)成分對分類貢獻(xiàn)較大，見圖14、圖15。該結(jié)果在統(tǒng)計分析角度進(jìn)一步對白茅根和茅根炭指紋圖譜對比分析進(jìn)行驗證，并篩選出炒炭前后差異性化合物，其中峰6和13被指認(rèn)為5-羥甲基糠醛和綠原酸，其他5個色譜峰有待于進(jìn)一步確認(rèn)其結(jié)構(gòu)。

圖13 白茅根和茅根炭樣品的OPLS-DA模型得分圖

圖14 白茅根和茅根炭樣品的OPLS-DA模型S-plots圖

圖15 OPLS-DA模型中共有峰的VIP值

3 討論

本文前期對供試品溶液的提取條件進(jìn)行了篩選，分別考察了提取方法(超聲、回流)、提取溶劑(30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)、提取時間(回流1 h、2 h、3 h、4 h)的影響，結(jié)果表明以70%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶20，回流提取3 h時，提取較為完全，指紋圖譜的峰容量較大，且各色譜峰的響應(yīng)值均較高，基線平穩(wěn)，故選擇該條件。

本實驗還考察了不同色譜柱Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Dikma Platisil Dos C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相(乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸水)，檢測波長(278 nm、280 nm、284 nm、323 nm)，柱溫(25 ℃、30 ℃)，檢測器(蒸發(fā)光散色檢測器、紫外檢測器)的影響。比較不同色譜條件下指紋圖譜中各色譜峰的分離效果及其響應(yīng)值大小，最終確定文中最佳色譜條件。

根據(jù)文獻(xiàn)[26-27]報道，臨床試驗證明茅根炭的收斂止血之功遠(yuǎn)優(yōu)于鮮茅根和白茅根，可能與5-羥甲基糠醛的積累相關(guān)，該成分究竟與收斂止血的功效有何相關(guān)作用，其收斂止血之功是否與茅根炭中新生成的化學(xué)成分有關(guān)需進(jìn)一步通過藥理試驗進(jìn)行驗證。指紋圖譜中化學(xué)成分類型及含量變化與白茅根與茅根炭的藥理作用有何關(guān)系？對于不同炮制飲片的質(zhì)量控制方法如何建立？以上問題值得我們深入研究。

綜上所述，本文建立的指紋圖譜測定方法準(zhǔn)確可靠，簡便易行，可較全面地反映白茅根炮制前后化學(xué)成分的變化情況，為白茅根藥材和飲片的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及其質(zhì)量控制及評價提供了參考。