肖丹 蘭長駿 楊琴 劉陽 譚青青 廖萱

近視是最常見的一種屈光不正，它的發(fā)病率和嚴(yán)重程度正在逐年增加。預(yù)計到2050年近視患者將達(dá)到世界人口的49.8%，且近10.0%的人將會成為高度近視[1]。目前人們普遍認(rèn)為近視是一種遺傳和環(huán)境因素共同作用的復(fù)雜疾病。近年來，科研人員利用全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome wide association study，GWAS)進(jìn)行了大量的研究，成功鑒定了新的近視易感基因座[2-3]，也對近視相關(guān)的環(huán)境因素[4-5]進(jìn)行了分析。GWAS的研究結(jié)果表明，光依賴性視網(wǎng)膜-鞏膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)會引起屈光不正，進(jìn)一步證實(shí)了近視的“視網(wǎng)膜局部調(diào)控學(xué)說”[6]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在近視發(fā)生發(fā)展的過程中，作為信號中繼站的視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)和脈絡(luò)膜[7]，以及作為重要信號分子的視黃酸都發(fā)揮重要作用[8]。

視黃醇脫氫酶5(RDH5)基因?yàn)橐朁S酸代謝相關(guān)基因，主要表達(dá)于RPE細(xì)胞并參與視覺循環(huán)中11-順-視黃醇的循環(huán)。研究人員基于大規(guī)模近視GWAS所得數(shù)據(jù)[9-10]，利用生物信息學(xué)方法在近視顯著關(guān)聯(lián)的遺傳易感基因區(qū)域及位點(diǎn)中鑒定出潛在的功能變異RDH5 rs3138144，其等位基因頻率分布在近視組與對照組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，并且多項(xiàng)生物信息學(xué)證據(jù)支持其具有功能效應(yīng)[11]。本研究進(jìn)一步調(diào)查近視相關(guān)基因RDH5內(nèi)含子區(qū)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)rs3138144(G>C)對其啟動子功能的影響，探討RDH5基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，以期為近視發(fā)病機(jī)制的研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及質(zhì)粒人RPE細(xì)胞株ARPE-19(四川大學(xué)華西醫(yī)院)，人腎上皮293T細(xì)胞系HEK293(川北醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室)，DH5α大腸桿菌細(xì)胞株(天根生物公司)，雙熒光素酶報告載體pGL3-Basic 和pRL-TK(Promega公司)。

1.1.2 主要試劑限制性核酸內(nèi)切酶試劑盒(美國Thermo fisher公司)，DNA聚合酶試劑盒(美國NEB公司)，雙熒光素酶報告基因分析系統(tǒng)試劑盒(Promega公司)，X-tremegene HP DNA Transfection Reagent試劑盒(瑞士羅氏公司)，優(yōu)質(zhì)胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，QIAquiek Nucleotide Removal Kit及Quigen Plasmid Midi Kit試劑盒[安諾倫(武漢)生物科技有限公司]，質(zhì)粒提取試劑盒(中國天根生化科技有限公司)，基因組DNA提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 RDH5啟動子及其SNP位點(diǎn)的雙熒光素酶載體構(gòu)建將RDH5基因(NC_000012.12)中從初始密碼子ATG往前擴(kuò)增1500 bp的5’端上游調(diào)控區(qū)域作為擬研究的啟動子片段，以包含rs3138144位點(diǎn)的長220 bp的區(qū)段作為研究的內(nèi)含子片段。利用Primer Premier 5.0設(shè)計引物，上游引物為5’-GATAGGTACCAATACGCCTGGCATCCAAG-3’，下游引物為5’-GATCTCGAGAGCTGGAGCCCAAGTGAC-3’，擴(kuò)增出含rs3138144 G/G基因型內(nèi)含子片段。另取同一人類基因組 DNA 為模板，設(shè)計引物，上游引物為5’- CAAATACAGCGTCTGCCCACATCTTTGC-3’，下游引物為5’- CAGACGCTGTATTTGTGGCTAACTTAAC-3’，擴(kuò)增出含rs3138144 C/C基因型內(nèi)含子片段。隨后，95 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性 30 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸50 s，30個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。之后將擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。測序正確的DNA擴(kuò)增片段與pGL3-Basic進(jìn)行酶切及DNA連接，得到熒光素酶表達(dá)載體rs3138144熒光素酶報告基因質(zhì)粒野生型(pGL3-RDH5-G)和rs3138144熒光素酶報告基因質(zhì)粒突變型(pGL3-RDH5-C)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，氨芐青霉素篩選，陽性克隆重組質(zhì)?；厥蘸蠼?jīng)雙酶切瓊脂糖凝膠電泳鑒定及測序驗(yàn)證。

1.2.2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞及雙熒光素酶相對活性檢測取細(xì)胞融合度約60%的ARPE-19細(xì)胞及HEK293細(xì)胞，使用X-tremegene HP DNA Transfection Reagent進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。將pGL3-RDH5-G、pGL3-RDH5-C與pRL-TK共轉(zhuǎn)染；同時設(shè)定pGL3-Basic作為對照；再設(shè)定一孔細(xì)胞單獨(dú)轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白質(zhì)粒以控制轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行熒光素酶相對活性測定，使用螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性比值來表示啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。

1.2.3 電泳遷移率變動分析合成包含RDH5內(nèi)含子區(qū)候選功能SNP在內(nèi)的約25 bp大小的核苷酸序列作為探針(見表1)，用熒光素標(biāo)記探針5’末端，通過寡核苷酸退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)并進(jìn)行純化。按照核蛋白抽提試劑盒說明書抽提ARPE-19細(xì)胞核蛋白進(jìn)行DNA-蛋白結(jié)合反應(yīng)。反應(yīng)完成后，將電泳獲得的膠塊取出并避光，置于BIO-RAD chemi-DOC中進(jìn)行熒光成像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件和GraphPad Prism 6.0進(jìn)行統(tǒng)計分析與繪圖。計量資料均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。電泳遷移率變動分析條帶使用Image J 1.8.0軟件進(jìn)行灰度值分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 RDH5基因啟動子區(qū)重組質(zhì)粒結(jié)果驗(yàn)證成功克隆到1500 bp長度的RDH5啟動子片段，以 ARPE-19細(xì)胞總DNA為模板，PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果顯示目的片段大小約1500 bp，與預(yù)期結(jié)果一致，克隆成功(圖1)。

圖1 RDH5基因啟動子片段瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

2.2 RDH5基因內(nèi)含子區(qū)重組質(zhì)粒測序結(jié)果將構(gòu)建的pGL3-RDH5-G/C重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序，測序結(jié)果與GeneBank中RDH5基因啟動子區(qū)序列一致，兩種重組質(zhì)粒在-200位點(diǎn)堿基分別為G和C，存在一個堿基差異(圖2)。

2.3 rs3138144位點(diǎn)熒光素酶相對活性將重組質(zhì)粒pGL3-RDH5-G、pGL3-RDH5-C、空質(zhì)粒pGL3-Basic分別與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染于ARPE-19細(xì)胞和HEK293細(xì)胞。重組質(zhì)粒熒光素酶相對活性參考對照進(jìn)行校正。在ARPE-19細(xì)胞中，野生型rs3138144位點(diǎn)熒光素酶相對活性為0.806±0.156，突變型為0.525±0.130，對照為0.085±0.027，野生型熒光素酶相對活性高于突變型及對照，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)。在HEK293細(xì)胞中，野生型rs3138144位點(diǎn)熒光素酶相對活性為0.075±0.013，突變型為0.040±0.006，對照為0.004±0.001,野生型熒光素酶相對活性高于突變型及對照，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)。

2.4 rs3138144不同等位基因與核蛋白結(jié)合能力差異rs3138144位點(diǎn)不同等位基因與核蛋白結(jié)合的電泳遷移率變化分析結(jié)果見圖3。圖中泳道2與泳道6形成了結(jié)合條帶，表明等位基因G及等位基因C均能與核蛋白中的某種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，灰度值分析結(jié)果提示，等位基因G結(jié)合能力更強(qiáng)；泳道3隨著G型冷探針的加入，結(jié)合條帶逐漸消失，而加入C型冷探針的泳道4，結(jié)合條帶卻沒有明顯變化；泳道7隨著G型冷探針的加入，結(jié)合條帶明顯消失，而加入C型冷探針的泳道8，結(jié)合條帶變淡。說明G等位基因的結(jié)合為特異性結(jié)合。

圖3 rs3138144位點(diǎn)不同等位基因與核蛋白結(jié)合的電泳遷移率分析結(jié)果

3 討論

全基因組關(guān)聯(lián)分析和外顯子測序已經(jīng)成為尋找近視或屈光不正致病基因的主要手段。GWAS鑒定出的新近視易感基因RDH5位于12號染色體長臂，由4376個堿基對組成，編碼的RDH5為含318個氨基酸的同型二聚體，特異性以11-順式-視黃醇、9-順式-白藜蘆醇和13-順式-視黃醇作為底物，主要產(chǎn)物是在視覺周期中起關(guān)鍵作用的11-順式-視黃醛[12]。人RDH5基因的突變常導(dǎo)致視桿細(xì)胞及視錐細(xì)胞感光色素再生延遲[13]。

近年來，新的RDH5基因突變位點(diǎn)及其相應(yīng)的視網(wǎng)膜病變表型相繼被報道，提示RDH5在維持RPE和光感受器功能方面扮演著重要角色[14-16]。Sergouniotis等[17]通過對8個先天性夜盲癥家系中9例患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)患者的視網(wǎng)膜電流圖均顯示中度至重度視桿細(xì)胞功能障礙，推測可能由RDH5基因突變導(dǎo)致類視黃醇衍生的熒光團(tuán)缺乏所致。類視黃醇是一大類聚異戊二烯脂質(zhì)，調(diào)節(jié)脊椎動物多種重要的生物學(xué)過程，如胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化和凋亡，以及維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)等[18]。類視黃醇包括視黃醇及其天然和合成衍生物視黃醛、視黃酸等，各種結(jié)構(gòu)間通過體內(nèi)視黃醇脫氫酶類的催化反應(yīng)相互轉(zhuǎn)化。近年來大量研究表明，近視患者的眼軸增長與視黃酸關(guān)系密切。此外，Mao等[19]發(fā)現(xiàn)在負(fù)透鏡誘導(dǎo)的光學(xué)離焦性近視豚鼠中，視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜視黃酸表達(dá)均升高；McFadden等[20]研究發(fā)現(xiàn),在形覺剝奪性近視豚鼠的視網(wǎng)膜中視黃酸含量升高。最近，Liu等[21]通過共定位RPE定量性狀位點(diǎn)與近視GWAS候選基因，發(fā)現(xiàn)RDH5基因位點(diǎn)與近視存在關(guān)聯(lián)。

然而GWAS已經(jīng)確定的許多與疾病和性狀相關(guān)的非編碼變異僅是直接功能性變異所在的單倍型的“標(biāo)簽”[22]，而從相關(guān)標(biāo)簽SNP里找到功能性致病變異以及相關(guān)候選基因則成為了研究工作的難點(diǎn)[23]。SNP是人類可遺傳變異中最常見的一種，在人類基因組中廣泛存在，已成為當(dāng)今基因組研究的主要遺傳標(biāo)記方法[24]?；?3%以上的SNP位于編碼序列之外，如基因間和內(nèi)含子區(qū)域，揭示出非編碼區(qū)域可能是大量遺傳信息發(fā)揮作用的關(guān)鍵[22]。近年來人類基因組研究加深了人們對這些位于非編碼序列的SNP對基因表達(dá)調(diào)控的認(rèn)知，如通過改變調(diào)控元件、拼接模式、外顯子的上游和下游的拼接增強(qiáng)子、內(nèi)含子的拼接增強(qiáng)子等影響基因的轉(zhuǎn)錄過程，進(jìn)而改變mRNA的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，影響下游蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能，最終可能造成個體對疾病易感性的差異。由于非編碼區(qū)(啟動子或內(nèi)含子區(qū)域)的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)SNP等位基因的差異無法在mRNA得到反映，通常以該SNP位點(diǎn)附近序列為對象，通過報告基因研究不同等位基因?qū)υ撔蛄袉幼踊钚缘挠绊懀蛲ㄟ^電泳遷移率變動分析不同等位的寡核苷酸探針結(jié)合核蛋白或轉(zhuǎn)錄因子能力的差異。rs3138144位點(diǎn)位于RDH5基因的內(nèi)含子區(qū)域，通過影響pre-mRNA的剪接或影響基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性參與基因的表達(dá)調(diào)控[25]。

本研究通過將含rs3138144位點(diǎn)G等位基因的人RDH5啟動子片段克隆入pGL3-Basic載體，成功構(gòu)建了RDH5基因內(nèi)含子區(qū)多態(tài)位點(diǎn)pGL3-RDH5-G載體，通過點(diǎn)突變得到pGL3-RDH5-C載體，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒(pRL-TK)共轉(zhuǎn)染ARPE-19與HEK293兩種細(xì)胞，結(jié)果顯示兩種重組質(zhì)粒的細(xì)胞裂解液熒光素酶相對活性與空載質(zhì)粒相比均明顯增強(qiáng)，表明該RDH5基因啟動子片段在ARPE-19細(xì)胞中具有啟動子活性。而在HEK293細(xì)胞中，熒光素酶相對活性明顯較在ARPE-19細(xì)胞中低，進(jìn)一步證實(shí)了RPE細(xì)胞中RDH5基因啟動子活性較高。并且，在兩種細(xì)胞中，pGL3-RDH5-G熒光素酶相對活性均高于pGL3-RDH5-C，說明rs3138144位點(diǎn)影響RDH5基因轉(zhuǎn)錄活性，攜帶G等位基因的啟動子轉(zhuǎn)錄活性高于C等位基因。同時在電泳遷移率變動分析中，觀察到野生型G型探針及突變型C型探針均能與核蛋白中的某種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而導(dǎo)致電泳遷移率發(fā)生變化，但G型探針的結(jié)合力明顯較C型探針強(qiáng)。

本研究表明，RDH5基因內(nèi)含子區(qū)SNP位點(diǎn)rs3138144(G>C)可以影響RDH5基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性。該基因?qū)曇赘行缘挠绊懣赡芡ㄟ^視黃酸信號通路實(shí)現(xiàn)，其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。