張曉彬，倪茂君，王靜霞，彭朝榮，陳竹平

(四川省原子能研究院 輻照保藏四川省重點實驗室，成都 610101)

目前中藥提取方法多采用傳統(tǒng)溶劑提取法，有效成分損失較多，尤其是水不溶性成分；提取過程中有機溶劑可能與有效成分作用，使其失去原有活性；非有效成分不能被最大限度地除去，濃縮度不夠；提取液中除有效成分外，雜質(zhì)較多；高溫操作引起熱敏性有效成分的大量分解等[1]。特別是隨著中藥材使用量的增大，中藥材品質(zhì)參差不齊，同樣造成提取效率低，品質(zhì)差。發(fā)展中草藥先進提取技術(shù)是中草藥提取的重點發(fā)展方向。

輻照技術(shù)是以高能射線照射為物質(zhì)提供高能量離子，使物質(zhì)產(chǎn)生降解或化學反應，具有常溫操作、環(huán)保無污染、穿透性好等優(yōu)點，與中藥材炮制有異曲同工之處。目前已證明其安全性，并廣泛用于中藥材輻照滅菌，而研究表明，輻照可提高綠茶中茶多酚含量，提高抗氧化活性，減小氣味和顏色[2]；龍金花等[3]研究發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)水提取法、溶劑提取法相比，輻照預處理輔助提取五倍子單寧酸的得率分別提高了15.13%和20.13%。與中藥材輻照滅菌應用相比，高能射線輻照在中藥材其他方面的應用研究相對較少[4-9]。根據(jù)輻照技術(shù)特點及中藥材有效成分多樣性和化學組成特殊性，將輻照技術(shù)作為新能源和新方法應用于中藥材有效成分提取、品質(zhì)提升等領(lǐng)域可提高經(jīng)濟效益，促進中藥材、中藥企業(yè)現(xiàn)代化發(fā)展，具有巨大的經(jīng)濟和社會價值。

根據(jù)衛(wèi)生部發(fā)部的《60Co輻照中藥滅菌劑量標準》[衛(wèi)藥發(fā)1997第38號]，國家科委“七五”公關(guān)項目“60Co-γ射線輻照中藥質(zhì)量評價研究”、國家科委“八五”公關(guān)項目“60Co輻照中藥滅菌劑量標準的應用研究”，中藥輻照滅菌多使用的最大吸收劑量為6 kGy,對于紫苑、錦燈籠、乳香、天竺黃、補骨脂輻照滅菌時最大吸收劑量不超過3 kGy，含有龍膽苦苷的秦摎和龍膽不得輻照滅菌。本文選取人參、黃連、黃芪、川芎、天麻、丹參6種中藥材，在中藥材常規(guī)提取的基礎(chǔ)上，研究輻照輔助處理對中藥材有效成分提取率的影響，篩選可用于輻照輔助提取的中藥品種及有效成分，為進一步分離、純化提供數(shù)據(jù)支撐，為輻照加工技術(shù)在中藥材提取領(lǐng)域的應用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 主要儀器與裝置

高效液相色譜儀(HPLC)：UltiMate3000，美國Dionex公司；紫外分光光度計：Evolution 220，美國Thermo Scientific公司；數(shù)控超聲波清洗器：KH2200DE型，功率100 W，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

1.2 主要材料與試劑

人參、黃連、黃芪、川芎、天麻、丹參：均為大宗藥材，其中川芎、天麻、黃連、丹參均為四川產(chǎn)道地藥材，購自太極大藥房，藥材打粉后過40目篩備用；中草藥提取物對照品：提取物標準品，成都曼斯特生物科技有限公司；乙醇、甲醇：分析純，成都市科龍化工試劑廠；超純水：18.25 MΩ·cm，實驗室自制。

2 實驗方法

將中藥材粉末材料分裝為每份10 g，送至四川省原子能研究院輻照工程中心，分別使用60Co-γ射線輻射裝置和GJ-2工業(yè)電子加速器(2 MeV，20 kW)進行輻照處理，吸收劑量為5、15、30 kGy。處理后對不同藥材有效成分進行提取與檢測。

2.1 川芎

取未輻照、60Co-γ射線及電子束輻照后的芎粉末0.5 g，精密稱定，置50 mL細口絲口瓶中，加入70%甲醇50 mL，50 ℃加熱超聲提取30 min，冷卻后再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻靜置，取上清液，用0.22 μm濾膜過濾，取濾液送液相色譜檢測。對照品為阿魏酸，檢測柱為C18柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，以甲醇-1%醋酸溶液(30∶70)為流動相，檢測波長321 nm，進樣量10 μL。按公式(1)計算相對提取率：

相對提取率=Yi/Y0×100%

(1)

其中，Yi為不同處理條件提取量，Y0為未處理樣品提取量。

2.2 天麻

取未輻照、60Co-γ射線及電子束輻照后的天麻粉末2 g，精密稱定，置50 mL細口絲口瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，攪拌并稱定重量，50 ℃超聲提取2 h，冷卻，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量。天麻提取液用0.22 μm的針頭過濾器過濾，取續(xù)濾液約12 mL送液相檢測。對照品為天麻素，檢測柱為C18柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，以乙腈-0.05%磷酸溶液(3∶97)為流動相，檢測波長220 nm，進樣量10 μL。按公式(1)計算相對提取率。

2.3 丹參

取未輻照、60Co-γ射線及電子束輻照后丹參粉末，精密稱量0.3 g，置50 mL細口絲口瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲提取30 min，冷卻后再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，補足后的提取液送液相色譜檢測。色譜柱選用C18色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，二元線性梯度洗脫，流動相為乙腈(A)和0.02%磷酸水溶液(B)；洗脫梯度如下：0～20 min(80%B)，20～50 min(20%B)，50～55 min(80%B)，柱溫25 ℃，流速0.4 mL/min；進樣量5 μL。按公式(1)計算相對提取率。

2.4 人參

取未輻照、60Co-γ射線輻照后的人參粉末，精密稱取1 g上述人參粉末樣品，加入70%乙醇15倍量，超聲提取3次，每次1 h，合并提取液，濾過，濾液用70%乙醇定容至50 mL，過0.22 μm濾膜，作為樣品溶液進行高效液相色譜檢測。色譜柱為 C18柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，柱溫25 ℃；二元線性梯度洗脫，流動相為乙腈(A)和蒸餾水(B)；洗脫梯度如下：0～18 min(85%B)，18～28 min(77%B)，28～47 min(70%B)，47～52(56%B)，52～69 min(32%B)，69～84 min(0%B)，84～89 min(85%B)；柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min；進樣量5 μL。

以紫外分光光度法檢測人參總皂苷含量，按公式(1)計算相對提取率。

2.5 黃連

取未輻照、60Co-γ射線及電子束輻照后的天麻粉末0.2 g，精密稱定，置50 mL細口絲口瓶中，加入甲醇-鹽酸(100∶1)的混合溶液20 mL，密塞，稱定重量，超聲提取30 min，冷卻后稱定重量，用甲醇補足減失的重量。色譜柱選用C18色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，流動相為乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(30∶70)，檢測波長345 nm；流速0.7 mL/min，進樣量10 μL。按公式(1)計算相對提取率。

2.6 黃芪

取未輻照、60Co-γ射線及電子束輻照后的黃芪粉5 g，加入8倍量pH為9的氧化鈣堿性水溶液和5%的乙醇，稱重后于50 ℃超聲提取30 min，過濾收集濾液，重復提取，合并2次濾液，提取液經(jīng)濃縮后，90%乙醇沉淀，離心收集多糖，上清液經(jīng)濃縮后二次沉淀，合并多糖，干燥得黃芪粗多糖。

按以下公式計算粗多糖得率：

粗多糖得率=粗多糖含量/黃芪粉含量×100%

(2)

取0.1 g粗多糖，定容至10 mL，配置成1%濃度的黃芪多糖溶液，按苯酚硫酸法測定提取液中黃芪多糖含量，檢測波長490 nm。

2 結(jié)果與討論

考察不同輻照源及吸收劑量對中草藥有效成分的影響，選取60Co及電子加速器兩種輻照源，參照《60Co輻照中藥滅菌劑量標準》，中藥輻照滅菌多使用的最大吸收劑量為6 kGy，選擇5 kGy輻照組作為對照，15 kGy、30 kGy、40 kGy輻照組為吸收提取實驗劑量。

2.1 輻照對川芎有效成分的影響

阿魏酸是川芎中有機酸類主要有效成分，約占生藥含量的0.1%～0.2%，阿魏酸及其衍生物可抑制血小板聚集，抗血栓形成，抗炎止痛等，輻照對阿魏酸的影響示于圖1。從圖1中可以看出，輻照源對阿魏酸含量的影響有較大差異。隨著吸收劑量的增加，不同輻照源下阿魏酸含量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。60Co-γ射線輻照下阿魏酸含量和提取率明顯高于電子加速器輻照，采用60Co-γ輻照，阿魏酸分解率較低，15 kGy情況下僅減少4.18%；電子加速器輻照下，阿魏酸在5 kGy輻照時即快速分解，30 kGy時提取率為未輻照時的92.60%，含量減少7.7%。

A—未輻照；B—60Co-γ輻照5 kGy；C—15 kGy；D—30 kGy；E—電子加速器輻照5 kGy；F—15 kGy；G—30 kGy

取液高效液相色譜圖及阿魏酸結(jié)構(gòu)示于圖2。從圖2中可以看出，輻照處理后，色譜圖中主要出峰時間及峰面積無明顯差異，表明阿魏酸結(jié)構(gòu)無明顯改變。其提取含量降低可能是由于分子結(jié)構(gòu)中含有活性羥基、羧基及雙鍵等官能團，在不同能量作用下部分分子結(jié)構(gòu)發(fā)生化學反應造成的，瞬時能量越高，反應越大，因此不同輻照源輻照輔助處理后提取率差異較大。

2.2 輻照對天麻有效成分的影響

中藥天麻的主要有效成分為天麻素，具有較好的鎮(zhèn)靜和安眠作用，對神經(jīng)衰弱、失眠、頭痛癥狀有緩解作用。輻照輔助處理對天麻有效成分提取的影響列于表1。從表1中可以看出，60Co-γ射線輻照與電子加速器輻照結(jié)果一致，均隨著吸收劑量的增加逐漸減少，二者無顯著差異。這一結(jié)果可能與天麻素分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。

表1 輻照對天麻有效成分的影響

天麻提取液高效液相色譜圖及天麻素結(jié)構(gòu)示于圖3。從圖3中可以看出，不同輻照處理后，天麻提取液液相色譜圖無明顯差異，表明輻照對天麻提取液中物質(zhì)結(jié)構(gòu)無明顯改變。天麻素分子中含有大量羥基及醚鍵，但分子結(jié)構(gòu)中含有較穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，因此，隨著輻射劑量增大，可能導致其分子中醚鍵發(fā)生斷裂，從而使天麻素檢測含量降低。

A—未輻照；B—60Co-γ輻照5 kGy；C—15 kGy；D—30 kGy；E—電子加速器輻照5 kGy；F—15 kGy；G—30 kGy

2.3 輻照對丹參有效成分的影響

丹參主要活性成分包括脂溶性成分(丹參酮類、丹參內(nèi)酯等)和水溶性成分(丹參素、丹酚酸等)，甲醇提取獲得的有效成分以酮類為主，總丹參酮有抗菌、消炎、活血化瘀、促進傷口愈合等多方面作用。輻照對丹參脂溶性成分的影響列于表2。從表2中可以看出，在30 kGy以內(nèi)輻照處理后，丹參脂溶性成分均出現(xiàn)先減小后增大的趨勢。不同輻照源中，60Co-γ輻照對丹參脂溶性成分影響較大：電子加速器輻照30 kGy隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA分別減少3.32%、4.57%和4.05%，而60Co-γ輻照30 kGy后分別減少8.86%、5.14%和3.85%。丹參酮ⅡA相對其他脂溶性成分變化率較小，這可能與其相對穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)有關(guān)。

表2 輻照對丹參脂溶性有效成分的影響

丹參提取液高效液相色譜圖及丹參酮類結(jié)構(gòu)示于圖4。從圖4中可以看出，輻照輔助處理后丹參提取液色譜圖無明顯變化，表明其主要成分結(jié)構(gòu)無明顯改變。從脂溶性丹參酮結(jié)構(gòu)中可以看出，丹參酮為菲醌類化合物，分子骨架中發(fā)生共軛形成大π鍵，丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和隱丹參酮分子共軛體系依次縮小，從而導致其輻射效應的不同。

A—未輻照；B—60Co-γ輻照5 kGy；C—15 kGy；D—30 kGy；E—電子加速器輻照5 kGy；F—15 kGy；G—30 kGy

2.4 輻照對人參有效成分的影響

不同人參皂苷液相檢測結(jié)果示于圖5。從圖5中可以看出，輻照對不同人參皂苷的影響具有顯著差異。其中，隨吸收劑量增加，人參三醇皂苷Re含量分別降低0.9%、9.74%和25.34%；而Rg2變化率則為-8.15%，18.77%和4.48%，當吸收劑量為15 kGy時具有較大值。人參二醇皂苷中，人參皂苷Rb1的含量隨著吸收劑量的增加，呈逐漸上升趨勢，15 kGy有最大值4.17 mg/g；Rg3含量先減小后增大，15 kGy有最大值；而Rd則分別降低0%，5.75%和16.52%。造成這一結(jié)果的原因可能是人參皂苷種類繁多，因此在輻照過程，皂苷的降解造成總皂苷含量降低，但也有可能形成部分皂苷間的相互轉(zhuǎn)化，從而提高某種皂苷含量。

圖5 輻照對人參皂苷成分含量的影響

輻照對人參總皂苷提取得率的影響列于表3。從表3中可以看出，隨著吸收劑量增大，人參總皂苷含量逐漸降低，輻照易造成人參皂苷結(jié)構(gòu)的改變和降解。人參皂苷都具有相似的基本結(jié)構(gòu)，都含有由30個碳原子排列成四個環(huán)的甾烷類固醇核。依糖苷基架構(gòu)的不同而被分為兩組：達瑪烷型和齊墩果烷型。達瑪烷類型包括兩類：人參二醇型-A型，苷原為20(S)-原人參二醇。包含了最多的人參皂苷，如人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、Rh2及糖苷基PD；人參三醇型-B型，苷原為20(S)-原人參三醇。包含了人參皂苷Re、Rg1、Rg2、Rh1及糖苷基PT。

表3 輻照對人參總皂苷的影響

2.5 輻照對提取黃連有效成分的影響

黃連中主要有效成分為生物堿類，輻照對黃連中鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿提取得率的影響列于表4。從表4中可以看出，輻照源對黃連中有效成分的影響具有明顯差異。60Co-γ射線輻照后，鹽酸巴馬汀及鹽酸小檗堿含量均隨著輻照劑量增加而先降低后增加，在15 kGy劑量下有最小值。而電子加速輻照后，5 kGy劑量下有效成分提取得率較低，隨著劑量增大，有效成分含量逐漸增大。

表4 輻照對黃連有效成分的影響

輻照對黃連有效成分提取率的影響示于圖6。由圖6可知，5 kGy電子束輻照后鹽酸巴馬汀與鹽酸小檗堿含量分別降低10.68%和7.87%，但增大吸收劑量至40 kGy后，黃連中鹽酸小檗堿含量提高2.29%，而鹽酸巴馬汀含量與未輻照相比降低1.68%。這一結(jié)果可能是由于黃連中具有較多纖維素及木質(zhì)素，木質(zhì)素以輻照交聯(lián)為主[10]，纖維素易于輻照裂解。低劑量輻照下，主要有效成分在提取過程中不易溶出，木質(zhì)素快速交聯(lián)導致溶出降低；隨著劑量增大，纖維素降解增大，有效成分溶出增大，提取率則相對增大。

圖6 輻照對黃連有效成分提取率的影響

黃連提取液高效液相色譜圖示于圖7，本研究考察了鹽酸小檗堿及鹽酸巴馬汀這兩種生物堿成分。從結(jié)構(gòu)上可以看出，小檗堿及巴馬汀為異喹啉生物堿，骨架結(jié)構(gòu)能夠耐受高輻射劑量。兩種生物堿的輻解反應雖然較難發(fā)生，但受到低劑量下木質(zhì)素輻照交聯(lián)相對分子質(zhì)量快速提高的限制，溶出能力受阻，因此高劑量輻照有利于黃連有效成分的溶出和提取率的提高。

A—未輻照(A)；B—60Co-γ輻照5 kGy；C—15 kGy；D—30 kGy(D)；E—電子加速器輻照5 kGy；F—15 kGy；G—30 kGy

2.6 輻照對黃芪有效成分的影響

黃芪多糖是黃芪主要有效成分之一，具有提高免疫力、抗氧化、抗癌、抗衰老等多重功效，應用較廣。黃芪經(jīng)不同輻射源及輻射劑量處理后，其提取液黃芪多糖含量與粗多糖提取得率示于圖8。從圖8中可以看出，不同輻照源下，黃芪粗多糖得率均隨著吸收劑量增大逐漸增大，電子加速器輻照(E/F/G)提取得率均大于60Co-γ輻照(B/C/D)；粗多糖中黃芪多糖含量均隨著吸收劑量增加先增大后減小，電子加速器輻照15 kGy具有極大值，明顯優(yōu)于60Co-γ輻照(B/C/D)。從圖中還可看出，劑量越高，粗多糖得率越高，但多糖含量越低，純度較低。造成這一結(jié)果的原因可能是，一方面黃芪多糖、纖維素等大分子均在高能量作用下產(chǎn)生降解，從而使提取過程中纖維素易于溶脹，黃芪多糖分子易于溶出，提取得率增大，但黃芪多糖分子量分布寬，隨著劑量增大，降解過程中小分子進一步降解成單糖或寡糖去除，失去生物活性，因此含量隨著吸收劑量增大而先增大后減??；另一方面，纖維素降解有利于多糖溶出，同時也有利于其他雜質(zhì)分子的溶出，造成雜質(zhì)含量增大，多糖純度降低，給后續(xù)純化造成難度。因此適宜的輻照工藝為電子加速器輻照15 kGy，該條件下黃芪多糖提取率和純度均較高。

A—未輻照(A)；B—60Co-γ輻照5 kGy；C—15 kGy；D—30 kGy(D)；E—電子加速器輻照5 kGy；F—15 kGy；G—30 kGy

2.7 輻照前后中藥材有效成分的變化

表5匯總了輻照對6種中藥材各種有效成分的影響，從表5中可以看到黃連的有效成分鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿，丹參中的脂溶性成分隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA在輻照中藥滅菌劑量標準規(guī)定的劑量下，有效成分含量改變不大；天麻、川芎等有效成分在輻照過程中易產(chǎn)生化學反應，有效成分含量降低，通過實驗表明這兩種中藥不適用于輻照輔助提??；黃芪經(jīng)輻照處理后，提取過程中纖維素溶脹增大，在標準規(guī)定的劑量范圍內(nèi)，5 kGy輻照組相對于未輻照組提取率提高17.59%，黃芪可以采用輻照輔助提取，提高黃芪多糖提取率。

表5 輻照對中藥材有效成分的影響

3 結(jié)論

(1)黃芪經(jīng)輻照處理后，其纖維素和多糖分子降解，提取過程中纖維素溶脹增大，多糖提取率提高，電子加速器優(yōu)于γ射線，最佳條件為電子束輻照15 kGy。該方法輻照工藝簡便，提取率高，有利于促進黃芪多糖提取工藝的進步，具有較大的應用前景。

(2)中藥材有效成分結(jié)構(gòu)對其輻照穩(wěn)定性具有較大的影響。黃連、丹參等有效成分具有較穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，低劑量下有效成分含量改變不大，高劑量下，纖維素降解，有利于有效成分的溶出，從而提高提取得率；而天麻、川芎等有效成分分子結(jié)構(gòu)中含有較多活性官能團，在輻照過程中易產(chǎn)生化學反應，造成結(jié)構(gòu)改變或降解，有效成分含量降低。根據(jù)中藥材有效成分結(jié)構(gòu)與反應活性，對中藥材輻照滅菌過程中的有效成分及藥理藥效研究具有重要的參考價值。

(3)輻照會造成人參皂苷化學鍵斷裂，從而造成人參皂苷含量降低；但在一定劑量下，可能促進不同人參皂苷間的轉(zhuǎn)化，從而使某類皂苷含量提高，對人參皂苷的研究具有重要意義。

(4)中藥材輻照不僅能夠起到滅菌的作用，通過輻照輔助提取考察中藥材有效成分的變化，篩選可用于輻照提取的中藥材及有效成分，為輻照加工技術(shù)在中藥材提取領(lǐng)域的應用提供研究基礎(chǔ)。