呼曉群 解萬翠，2 李 敏 董澤群 楊錫洪，2

(1. 青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院，山東 青島 266042；2. 山東省生物化學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266042)

海洋赤潮中有毒甲藻產(chǎn)生的毒素可經(jīng)食物鏈蓄積于貝類、魚類等體內(nèi)，對水產(chǎn)加工產(chǎn)業(yè)和公眾健康造成潛在威脅[1-2]。其中，麻痹性貝類毒素(Paralytic Shellfish Toxins，PSTs)毒性強(qiáng)、分布廣、衍生物多，甚至在北極楚科奇海和臨近北極的白令海的底棲軟體動(dòng)物也被PSTs污染[3]。中國最近一次的PSTs中毒事件發(fā)生在2019年5月，河北省秦皇島等地發(fā)生赤潮，期間有人疑似食用受PSTs污染的貽貝引起中毒。麻痹性貝類毒素通過阻斷神經(jīng)細(xì)胞膜上的鈉通道和抑制動(dòng)作電位的轉(zhuǎn)導(dǎo)來攻擊神經(jīng)系統(tǒng)。PSTs主要源自淡水藍(lán)藻和海洋鞭毛藻，如亞歷山大藻屬(Alexandrium)、裸甲藻屬(Gymnodinium)等。雙殼貝類由于其濾食性特征能過濾海水?dāng)z食有毒藻，并通過食物鏈中的營養(yǎng)轉(zhuǎn)移導(dǎo)致人類麻痹性貝類毒素中毒。近年來海洋污染加劇有害赤潮頻發(fā)，由此導(dǎo)致的PSTs污染及中毒事件日益受到人類的關(guān)注。

科研人員[4-7]在實(shí)驗(yàn)室條件下模擬雙殼貝類在自然條件下攝食有毒藻的過程，研究了PSTs從毒藻到貝類的蓄積、轉(zhuǎn)化及排出過程。文章擬從PSTs的蓄積、轉(zhuǎn)化、代謝及凈化對麻痹性貝類毒素的相關(guān)研究進(jìn)行綜述。

1 PSTs食物鏈蓄積的特異性

PSTs可通過食物鏈富集于許多海洋生物中，包括雙殼類、棘皮動(dòng)物、甲殼類動(dòng)物、被囊動(dòng)物、頭足類動(dòng)物、腹足動(dòng)物和魚類等，其蓄積具有物種特異性。Terrazas等[8]對智利部分海域的水生生物進(jìn)行了STX毒素組的毒性分析，發(fā)現(xiàn)毒素含量為巖石地層雙殼類>沙地雙殼類>腹足類>被囊類>棘皮類動(dòng)物>頭足類>魚類，且毒素含量較高的為膝溝藻毒素(GTX3/GTX2)>石房蛤毒素(STX)>膝溝藻毒素(GTX4/GTX1)>新石房蛤毒素(neoSTX)>脫氨甲?；扛蚨舅?dcSTX)。說明PSTs在整個(gè)食物鏈中的主要傳遞媒介為雙殼貝類，與之相比，魚類對PSTs的敏感程度比貝類更敏感，貝類可以累積一定量的毒素而本身無明顯不利反應(yīng)，但毒素在魚體內(nèi)較低水平累積便可導(dǎo)致魚類死亡。

貝類濾食產(chǎn)毒藻不具有選擇性，只要藻細(xì)胞大小合適，即可進(jìn)入貝體內(nèi)，PSTs最先累積在消化系統(tǒng)，之后隨血液流動(dòng)分散至其他組織。貝類蓄積PSTs的能力存在差異性，受貝種類、大小、暴露毒素期間的生理狀態(tài)以及環(huán)境狀況的影響，并且與其生長階段有關(guān)[9]。

毒素除蓄積含量有物種特異性外，在不同組織中的毒性分布也具有特定性。一般情況下，貝的運(yùn)動(dòng)組織如閉殼肌等蓄積PSTs較少，消化腺或內(nèi)臟團(tuán)是貝體內(nèi)PSTs累積最多的部位，蓄積含量最高可占貝體內(nèi)總毒素的98%，同時(shí)消化系統(tǒng)中毒素的排出也相對其他組織要快[10-11]，且PSTs在不同雙殼貝類組織中的蓄積含量存在差異，這與不同貝類之間對有毒藻的消化吸收差異及選擇性排出有關(guān)。Andres等[12]研究發(fā)現(xiàn)，前18 h內(nèi)毒素主要存在于貽貝的外套膜中，之后逐漸向腸道轉(zhuǎn)移，24 h后其主要蓄積部位為消化系統(tǒng)。Li等[13]對中國黃海北部的扇貝和蛤蜊進(jìn)行了毒素分析，發(fā)現(xiàn)PSTs主要累積在扇貝的消化系統(tǒng)中。Estrada等[14]用G.catenatum喂食扇貝(Nodipectensubnodosus)，發(fā)現(xiàn)消化腺中的PSTs濃度最高，其次是唇瓣、腸、鰓、外套膜和閉殼肌，內(nèi)臟中的毒素含量超過了貝體的80%。邴曉菲等[15]將櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)直接暴露于產(chǎn)毒藻，發(fā)現(xiàn)貝體存在PSTs累積和生物轉(zhuǎn)化，不同器官的PSTs累積含量按內(nèi)臟團(tuán)、性腺、外套膜和閉殼肌的順序依次降低。Oyaneder等[10]對智利部分海域的雙殼貝類不同組織中的毒素進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，各組織毒素含量為消化腺(81.5%)>斧足(8.6%)>外套膜(5.3%)>閉殼肌(4.6%)。厚蛤蜊[16]、麥哲倫海扇貝[17]以及薪蛤[18]、櫛孔扇貝[19]等貝類中的閉殼肌是累積毒素最少的組織。但毒素的蓄積規(guī)律在某些種類的貝中存在例外，如奶油蛤(Saxidomusgiganteus)將其毒素集中在含黑色素較多的進(jìn)出水管[20]。

2 PSTs的生物轉(zhuǎn)化

PSTs是一類四氫嘌呤三環(huán)化合物毒素的總稱，由STX及其衍生物組成，衍生物種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，且在特定條件下可以發(fā)生相互轉(zhuǎn)化，并對生物體內(nèi)的代謝產(chǎn)生影響。

2.1 PSTs的分類

1957年，STX毒素首次從阿拉斯加石房蛤(Saxidomusgigangteus)中被分離出。由于STX高極性特征使其具有較差的結(jié)晶條件，因此阻礙了其結(jié)構(gòu)的闡明，直至1975 年Bordner和Schantz兩個(gè)團(tuán)隊(duì)確定了STX的結(jié)構(gòu)(見圖1)。自發(fā)現(xiàn)以來，在多種生物體中相繼發(fā)現(xiàn)多種天然存在的STX類似物，統(tǒng)稱為PSTs(見表1)。

圖1 麻痹性貝類毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Figure 1 Chemical formula of paralytic shellfish toxins

表1 麻痹性貝毒的種類及結(jié)構(gòu)

續(xù)表1

對已發(fā)現(xiàn)的STX及其衍生物根據(jù)各可變?nèi)〈牟煌M(jìn)行分類命名，根據(jù)R4基團(tuán)的不同可將常見的毒素分為4類：氨基甲酸酯毒素、N-磺酰氨甲酰基毒素、脫氨甲?；舅?、脫氧脫氨甲?；舅?。此外，PSTs衍生物還包括N-羥基衍生物、鞘絲藻毒素(LWTX1-6)[21]、Zetekitoxin AB[22]、安息香酸鹽衍生物(GC1-6，GC1-6a，GCb1-6b)[23]，以及PSTs在貝類體內(nèi)的新型代謝產(chǎn)物(M1-12)[13,24-27]等，其中毒性最高的一類為氨基甲酸酯類毒素。

PSTs的結(jié)構(gòu)由于碳骨架的存在較為穩(wěn)定，但在一定條件下各可變?nèi)〈^易發(fā)生生物轉(zhuǎn)化。C11上的R2，R3取代基存在同分異構(gòu)現(xiàn)象，此外，毒性較小的PSTs也可轉(zhuǎn)化為毒性較大的類似物(如C-毒素→GTXs類)，反之亦然。因此，為了更準(zhǔn)確地預(yù)測毒性水平，需更清楚地了解PSTs的相互轉(zhuǎn)化。

2.2 PSTs的相互轉(zhuǎn)化

PSTs在貝類的累積傳遞過程中會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化反應(yīng)，且這種生物轉(zhuǎn)化能力存在明顯的種間差異，常見的蛤類、扇貝有較強(qiáng)的PSTs轉(zhuǎn)化能力，而牡蠣、貽貝和其他貝類的PSTs轉(zhuǎn)化能力相對較弱。田華等[4]通過培養(yǎng)A.minutum得到PSTs，研究了3種貝類的內(nèi)臟、肌肉組織中PSTs的體外轉(zhuǎn)化反應(yīng)，包括菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)和竹蟶(Solenstrictus)，發(fā)現(xiàn)PSTs的體外轉(zhuǎn)化存在明顯的種間差異和組織特異性，其中Chlamysfarreri內(nèi)臟對PSTs的轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)，Ruditapesphilippinarum和Solenstrictus的內(nèi)臟和肌肉對PSTs幾乎無轉(zhuǎn)化能力。類似地，邴曉菲等[15]研究指出，內(nèi)臟團(tuán)是扇貝體內(nèi)PSTs蓄積和代謝的主要組織。

天然存在的PSTs可以通過各種生物學(xué)因素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，而貝類的生物轉(zhuǎn)化會(huì)得到一些新的藻類不能單獨(dú)合成的PSTs產(chǎn)物，根據(jù)已有研究[17,26,28-30]，PSTs在貝內(nèi)的轉(zhuǎn)化(圖2)主要包括① C-11位羥基磺酸基的差向異構(gòu)化：甲藻細(xì)胞內(nèi)以β型(C2、C3、GTX3、GTX4)為主的毒素在經(jīng)貝類濾食后會(huì)向更穩(wěn)定的α型毒素(C1、C4、GTX2、GTX1)轉(zhuǎn)化，染毒2～5周后α∶β型毒素的比例趨于穩(wěn)定，約為3∶1；②N-1或C-11位的還原反應(yīng)：存在于貝類體內(nèi)的天然還原劑谷胱甘肽、半胱氨酸等可促使PSTs分子中N-1位-OH或C-11位-OSO3H基團(tuán)脫去，如NEO轉(zhuǎn)化為STX，C1/2、C3/4轉(zhuǎn)化為GTX5、GTX6；③ 水解反應(yīng)：N-磺酰氨甲酰基毒素(GTX5、GTX6和C1-4)在貝體內(nèi)或者低pH、溫度升高的條件下可轉(zhuǎn)化為相對應(yīng)的氨基甲酸酯類毒素(STX、NEO和GTX1-4)，該轉(zhuǎn)化會(huì)導(dǎo)致貝類總毒性升高；④ 酶促反應(yīng)：從雙殼貝類體內(nèi)分離出的氨甲?；饷改艽呋疪4基團(tuán)的氨甲?；騈-磺酰氨甲?；?，轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的脫氨甲?；惗舅?GTX1/4→dcGTX1/4、GTX2/3→dcGTX2/3以及C1/2→dcGTX2/3)，且β型有比α型毒素更快的水解速率；⑤ C-11位的羥基化：貝類中的PSTs脫掉C-11位的亞硫酸根，生成一個(gè)羥基或兩個(gè)羥基的衍生物(M-毒素)。

圖2 PSTs的生物轉(zhuǎn)化Figure 2 Biotransformation of different types of PSTs

近年來，隨著檢測技術(shù)和結(jié)構(gòu)解析方法的改進(jìn)，新型PSTs有所增加。Quilliam等[31]建立了親水交互作用液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(HILIC-ESI-MS)法，可同時(shí)分析主要的PSTs毒素。Dell’Aversano等[25]采用HILIC-ESI-MS法發(fā)現(xiàn)貽貝中存在毒藻中不存在的5種毒素類似物(M1～M5)，并通過串聯(lián)質(zhì)譜、1D和2D-NMR光譜以及化學(xué)互轉(zhuǎn)換試驗(yàn)確定了M1～M4的結(jié)構(gòu)。Li等[13]在中國北部沿海采集的有毒扇貝(Patinopectenyessoensis)和蛤(Saxidomuspurpuratus)中使用HILIC-ESI-MS法檢測到M1、M3和M5，以及3個(gè)未報(bào)告的假定代謝物M6、M8和M10。Ding等[26]收集并分析了2016年4月秦皇島中毒事件中的致病貽貝(Mytilusgalloprovincialis)毒素含量，檢測到濃度較高的新代謝物M2、M8和M10，微量的M4和M6，且在塔瑪亞歷山大藻ATHK藻株喂養(yǎng)的貽貝中檢測到了新型代謝產(chǎn)物M1、M2、M3、M7、M8和M9，這些產(chǎn)物大多毒性較低，其是否存在未發(fā)現(xiàn)的新型M類毒素結(jié)構(gòu)還有待研究。

根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)(分子量和產(chǎn)物離子譜)可以對各種新型代謝產(chǎn)物的形成進(jìn)行推測，Ding等[26]研究表明M1和M3可能是由C2轉(zhuǎn)化而來(如圖3所示)，而M7和M9可能是由C3/4轉(zhuǎn)換而來。此外，代謝物M2、M4和M6可能是GTX2/3的產(chǎn)物，而代謝物M8和M10可能來自GTX1/4；為了更具體地研究N-磺酰基氨甲?；惗舅氐拇x轉(zhuǎn)化，采用僅產(chǎn)生C1/2和GTX5(暴露于更簡單的PSTs譜)的塔瑪亞歷山大菌TIO108喂養(yǎng)未污染的貽貝，由于C1/2毒素的代謝，貽貝中產(chǎn)生了M1和M3。Che等[32]進(jìn)一步證實(shí)了化學(xué)轉(zhuǎn)化途徑M1→M3→M5，并確定了兩個(gè)新的轉(zhuǎn)化途徑：M2→M4→M6和NEO→M10。

2.3 氧化應(yīng)激和體內(nèi)代謝

PSTs與其他主要海洋污染物(重金屬、多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯和DDT)一樣，在進(jìn)入貝類或魚類等生物體后，會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)自由基水平，特別是增加活性氧(ROS)水平，當(dāng)ROS的產(chǎn)生超過抗氧化防御時(shí)，將誘導(dǎo)嚴(yán)重的氧化應(yīng)激，可能導(dǎo)致生物分子如DNA、蛋白質(zhì)、脂類和其他物質(zhì)的氧化損傷，同時(shí)，PSTs還會(huì)導(dǎo)致雙殼類動(dòng)物發(fā)生各種生化和細(xì)胞變化，包括抗氧化反應(yīng)、免疫防御和解毒過程，但生物體可通過調(diào)節(jié)自身的抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px、GSH-Rd)活力變化以減少危害[33-35]。

圖3 由C2轉(zhuǎn)化為M1和M3的生物轉(zhuǎn)化示意圖Figure 3 Determined biotransformation pathway of metabolites M1 and M3 from C2

邱江兵[36]通過模擬蝦夷扇貝和紫貽貝濾食塔瑪亞歷山大藻(Alexandriumtamarense，ATHK)發(fā)現(xiàn)，在PSTs的積累和凈化時(shí)期，活性氧ROS迅速生成并消失在扇貝和貽貝組織中，兩種不同的雙殼類中的活性氧ROS發(fā)生了不同的抗氧化酶反應(yīng)。扇貝組織中，SOD活性明顯受到抑制，而有毒藻對CAT活性沒有刺激作用；貽貝組織中，SOD和CAT活性均被誘導(dǎo)，能有效清除超氧陰離子自由基和H2O2，體現(xiàn)了喂養(yǎng)產(chǎn)毒藻A.tamarense的扇貝和貽貝的抗氧化酶的物種特異性反應(yīng)。Melegari等[37]將Neu-ro-2A細(xì)胞和綠藻Chlamydomonasreinhardtii暴露于STX，通過定量丙二醛水平作為脂質(zhì)過氧化的生物標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)STX可以誘導(dǎo)脊椎動(dòng)物細(xì)胞系的嚴(yán)重氧化應(yīng)激。

牡蠣(Crassostreagigas)對A.minutum的生理反應(yīng)非常復(fù)雜，涉及多種代謝系統(tǒng)，包括基于谷胱甘肽和鐵的代謝系統(tǒng)，以及其他解毒和/或抗氧化系統(tǒng)，并且指出負(fù)責(zé)呼吸和過濾的鰓作為雙殼類貝類與海水接觸的第一個(gè)器官，可能對A.minutum產(chǎn)生的細(xì)胞外毒素反應(yīng)強(qiáng)烈而產(chǎn)生基于谷胱甘肽的解毒途徑。與喂養(yǎng)無毒藻的牡蠣相比，太平洋牡蠣(Crassostreagigas)鰓中編碼抗氧化/解毒酶的7個(gè)基因的mRNA[如σ-谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，谷胱甘肽還原酶(GR)和鐵蛋白(Fer)]的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高。 GST、GR和Fer還可以促進(jìn)抗氧化功能，以防止增加的ROS對細(xì)胞的損害，這些活性氧或直接來自A.minutum細(xì)胞，或來自免疫應(yīng)答期間的牡蠣血細(xì)胞，或來自作為解毒副產(chǎn)物的其他鰓細(xì)胞[7]。Costa等[38]研究表明，裸甲藻G.Catenatum細(xì)胞被轉(zhuǎn)移至其他器官前保留在鰓中，由此產(chǎn)生一系列的消除和生物轉(zhuǎn)化途徑。Xie等[39]通過15N同位素替換A.minutum培養(yǎng)基中的14N，以15N標(biāo)記PSTs以期將15N-PSTs作為生物標(biāo)志物示蹤PSTs在貝類體內(nèi)的代謝。目前，PSTs在雙殼貝類體內(nèi)的代謝機(jī)制仍不明確，其在雙殼貝類體內(nèi)代謝的差異代謝物的篩選對其代謝機(jī)制的明確具有重要意義。

3 PSTs的消減及凈化

不同貝類對PSTs的積累能力存在較大差異，貝類毒素排出的速率因物種差異和季節(jié)不同而存在明顯差異[40]。與扇貝相比，牡蠣和貽貝表現(xiàn)出較快的解毒速度。Takata等[41]發(fā)現(xiàn)牡蠣在流動(dòng)海水中存活48 h內(nèi)排出62%的麻痹性貝類毒素。扇貝由于代謝率低，對PSTs的敏感性低導(dǎo)致其在組織中積聚毒素的程度更大，且在有毒藻華停止后，扇貝中的毒性滯留仍可持續(xù)數(shù)月之久[42]。Braga等[43]發(fā)現(xiàn)海水變暖和酸化會(huì)觸發(fā)貝類產(chǎn)生不同的適應(yīng)機(jī)制，適應(yīng)升溫的貽貝顯示較低的積累/消除率，而適應(yīng)酸化的貽貝顯示更高的積累毒素能力，但清除率更高。

貝類中PSTs的凈化方式可歸結(jié)為化學(xué)法、生物學(xué)法和物理法[44]。根據(jù)化學(xué)法規(guī)對PSTs的氯水降解是歐洲委員會(huì)批準(zhǔn)的一種凈化受污染產(chǎn)品的方法，但該方法存在氯殘留或副產(chǎn)品等問題[45-46]。生物學(xué)方法是利用微生物代謝[47-48]或酶[49-50]轉(zhuǎn)化貝類中的PSTs，但該方法存在效率低、成本高等問題。物理凈化是通過加熱、吸附和臨時(shí)凈化來消減PSTs的方法。暫養(yǎng)凈化期間，PSTs的排泄率受貝類品種[49]影響。食用無毒藻類可加速毒素排出[51]。由于加熱會(huì)改變貝類材料的性能，生物吸附法已成為去除PSTs[52]的研究熱點(diǎn)。

殼聚糖[5]、殼聚糖覆膜的貝殼粉[53]、黏土[54]、活性炭[55]和海藻多糖[56]等均可用作吸附PSTs的吸附劑。Xie等[5]發(fā)現(xiàn)殼聚糖對牡蠣(OstrearivularisGould)凈化去除PSTs的效果顯著。Qiu等[55]比較了8種不同粒徑的活性炭對PSTs的吸附效果，發(fā)現(xiàn)活性炭能有效加速麻痹性貝毒的脫除。Li等[54]發(fā)現(xiàn)改性黏土的應(yīng)用可以有效防止濾食性雙殼類攝入有毒藻類，并通過沉積物來減少毒素的積累，且沉積物中積累的毒素比扇貝組織中的毒素更快解毒。Romero等[57]制備了一種磁性共價(jià)有機(jī)骨架(COF)，將該復(fù)合材料應(yīng)用于海水中海洋生物毒素的磁力固相萃取，其效率較高。綜上表明，添加生物吸附劑可提高PSTs從染毒貝類中的排出速度。不同的吸附劑對PSTs的吸附機(jī)理不同，活性炭在吸附時(shí)，靜電作用與非靜電作用共同發(fā)揮作用，而海藻多糖的主要吸附機(jī)制是靜電作用。

4 結(jié)論

近年來發(fā)現(xiàn)的新型低毒M類毒素被認(rèn)為是貝類解毒過程的代謝中間體或終產(chǎn)物[34]，以此為貝類體內(nèi)PSTs代謝的靶標(biāo)，為研究PSTs在貝類體內(nèi)的代謝組學(xué)奠定了基礎(chǔ)。目前暫無PSTs毒素特效解毒劑，基于PSTs在貝類體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化及代謝的理論依據(jù)，能否將暫養(yǎng)凈化、生物吸附法、微生物代謝等凈化方式進(jìn)行優(yōu)化或結(jié)合，對水產(chǎn)品進(jìn)行高效脫毒仍需進(jìn)一步研究。此外，PSTs在貝類體內(nèi)蓄積、轉(zhuǎn)化及代謝機(jī)制的明確有助于科學(xué)地監(jiān)測PSTs的危害，為保障食品安全及保護(hù)水產(chǎn)品養(yǎng)殖加工產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供科學(xué)支撐。