陳 果 晏日安 黎海梅 周 華 李存芝

(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632)

番茄紅素(lycopene)是一種具有營(yíng)養(yǎng)與著色雙重功能的食品添加劑，屬于類胡蘿卜素的一種[1]。番茄紅素含有11個(gè)共軛雙鍵和兩個(gè)非共軛雙鍵，這種結(jié)構(gòu)所帶來(lái)的較好抗氧化能力使其在預(yù)防骨質(zhì)疏松、心血管等疾病、抗炎、降血脂及增強(qiáng)免疫力等方面具有重要的生物學(xué)功能[2-4]；番茄紅素還可以降低患前列腺癌、消化道癌、乳腺癌等疾病的概率，在防治神經(jīng)退行性疾病方面有積極作用[5-7]。番茄紅素的分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。

目前，科研工作者主要采用天然提取法[8]和微生物發(fā)酵法[9]來(lái)生產(chǎn)番茄紅素，化學(xué)合成法因具有產(chǎn)率高、成本低的特點(diǎn)[10]，也在積極的探索中。當(dāng)前最常用的方法按照關(guān)鍵反應(yīng)可分為5種：Wittig反應(yīng)法[11-13]、Wittig-Horner反應(yīng)法[14-15]、醛—砜法[16]、Heck烯化反應(yīng)法[17]和Ramberg-B?cklund成烯法[18]。目前只有Roche和BASE公司采用Wittig反應(yīng)法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，該法反應(yīng)速率快、產(chǎn)率高，但成本較高且使用的三苯膦試劑有毒，還會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物三苯膦氧化物，后處理困難[19]。為解決上述問(wèn)題，Babler等[15,20-23]采用Wittig-Horner反應(yīng)法，以2,7-二甲基-2,4,6-辛三烯-1,8-二醛(十碳烯醛)為關(guān)鍵中間體與多步反應(yīng)合成的3,7,11-三甲基-1,4,6,10-四烯十二烷基膦酸二乙酯(C15膦酸酯)以及其雙鍵異構(gòu)體經(jīng)Wittig-Horner反應(yīng)制備番茄紅素，該方法副反應(yīng)少，并且產(chǎn)生的副產(chǎn)物膦酸離子溶于水，易于分離[19]。番茄紅素合成子切斷方式如圖2(I)所示。但該方法C15磷酸酯的合成步驟較多[20-23]，中間產(chǎn)物2,7-二甲基-2,4,6-辛三烯-1,8-二醛制備步驟較長(zhǎng)，操作不易[24-25]。

十碳烯醛的合成子切斷方法如圖3所示。Arjan等[24]以富馬酸二乙酯為原料，所得十碳烯醛產(chǎn)率為40.5%，但反應(yīng)條件苛刻。楊澤慧等[25]以五碳醛為原料，所得十碳烯醛產(chǎn)率為48%，但反應(yīng)原料不易獲得。孫培東等[26]以1,4-二溴-2-丁烯和丙酮醛縮二甲醇為原料，所得十碳烯醛產(chǎn)率為58.7%。試驗(yàn)擬設(shè)計(jì)一種新的十二碳烯醛(5)全合成番茄紅素的策略，優(yōu)化番茄紅素合成路線，其合成子切斷方略如圖2(II)所示。

圖1 番茄紅素的全反式分子結(jié)構(gòu)Figure 1 The all-trans molecular structure of lycopene

圖2 番茄紅素的合成子切斷方略Figure 2 Lycopene synthesis sub-cutting strategy

圖3 十碳烯醛的合成子切斷方略Figure 3 C10-dialdehyde synthesis sub-cutting strategy

依據(jù)合成策略，試驗(yàn)擬使用2,6,10-三甲基-1,3,5,9-四烯十一烷基膦酸二乙酯(9)與3,8-二甲基-3,5,7-辛三烯-1,10-二醛(十二碳烯醛)(5)進(jìn)行Wittig-Horner反應(yīng)得到番茄紅素順?lè)串悩?gòu)體混合物，再通過(guò)轉(zhuǎn)位異構(gòu)得到全反式番茄紅素。中間體C14膦酸酯(9)可以通過(guò)假性紫羅蘭酮(8)與四乙基亞甲基二磷酸酯(9)進(jìn)行Wittig-Horner反應(yīng)生成，克服合成C15磷酸酯步驟多的缺點(diǎn)；中間體十二碳烯醛(5)由2-丁烯-1,4-二磷酸四乙酯(2)與4,4-二甲氧基-2-丁酮(3)通過(guò)Wittig-Horner反應(yīng)及水解反應(yīng)“一鍋法”生成，替代原中間體十碳烯醛，以此來(lái)優(yōu)化反應(yīng)步驟，并考察原料摩爾比、堿用量和水解酸化時(shí)間對(duì)合成產(chǎn)物(5)反應(yīng)過(guò)程的影響，以期為更有效合成番茄紅素提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

氫化鈉：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%，薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司；

叔丁醇鉀：99.8%，薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司；

1,4-二溴丁烯：99%，上海麥克林生化科技有限公司；

亞磷酸三乙酯：98%，薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司；

四乙基亞甲基二磷酸酯：98%，薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司；

無(wú)水二甲基亞砜：99.8%，薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司；

乙醚：分析純，廣州市梓興化玻儀器有限公司；

乙酸：99.5%，薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司；

無(wú)水四氫呋喃：99.8%，薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司；

4,4-二甲氧基-2-丁酮：90.0%，北京百靈威科技有限公司；

假性紫羅蘭酮：90.0%，薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司；

氘代氯仿：安諾論生物科技有限公司；

硅膠：200～300目，青島海洋化工有限公司；

二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉、氯化銨：分析純，上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

紅外光譜儀：EQUI-NO×55型，布魯克光譜儀器有限公司；

核磁共振波儀：AVANCEⅢ型，瑞士布魯克公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：N-1300型，東京理化器械株式會(huì)社；

磁力攪拌器：MS-H-Pro型，美國(guó)賽洛捷克公司；

電子轟擊電離質(zhì)譜儀：QTRAP4500型，美國(guó)Thermo公司；

低溫反應(yīng)儀：PSL-1820型，東京理化器械株式會(huì)社；

電子天平：AL204型，瑞士梅特勒—托利多公司；

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：7890A-5975C型，安捷倫科技有限公司；

高效液相色譜儀：LC-20AT型，島津企業(yè)管理有限公司；

高分辨質(zhì)譜：X500R QTOF型，上海愛(ài)博才思分析儀器貿(mào)易有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 合成路線 番茄紅素合成路線見圖4。

1.2.2 合成方法

(1) 2-丁烯-1,4-二磷酸四乙酯(2)的合成：將1,4-二溴丁烯(4.00 g，18.7 mmol)溶于亞磷酸三乙酯(18.50 g，111.4 mmol)中，160 ℃下磁力攪拌48 h并冷凝回流，采用薄層層析監(jiān)測(cè)(TLC)。待反應(yīng)結(jié)束并冷卻至室溫，柱層析純化(V二氯甲烷∶V甲醇=60∶1)，旋蒸洗脫液并真空干燥得到淺黃色液體2-丁烯-1,4-二磷酸四乙酯(2)(6.02 g,18.363 4 mmol)，產(chǎn)率為98.21%。

(2) 3,8-二甲基-3,5,7-三烯二醛(5)的合成：氮?dú)獗Ｗo(hù)下，200 mL圓底燒瓶中加入氫氧化鈉(2.40 g，60 mmol)和甲苯與環(huán)己烷(V甲苯∶V環(huán)己烷=1∶1)混合溶液15 mL。反應(yīng)瓶于0 ℃下攪拌，將2-丁烯-1,4-二磷酸四乙酯(1.97 g，6 mmol)溶于20 mL甲苯與環(huán)己烷(V甲苯∶V環(huán)己烷=1∶1)混合溶液中，并滴加至反應(yīng)瓶后，繼續(xù)攪拌30 min。將4,4-二甲氧基-2-丁酮(3.17 g，24 mmol)溶于20 mL甲苯與環(huán)己烷(V甲苯∶V環(huán)己烷=1∶1)混合溶液中，并滴加至反應(yīng)瓶后，繼續(xù)攪拌20 min。反應(yīng)液于室溫反應(yīng)4 h。待反應(yīng)結(jié)束，向反應(yīng)液中滴加40 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的氯化鈉溶液以淬滅反應(yīng)，用20 mL 無(wú)水乙醚萃取3次，用飽和氯化鈉洗滌有機(jī)層，減壓除去溶劑，得到含化合物4的混合物。

將得到的混合物4置于50 mL圓底燒瓶中，加入4 mL 冰乙酸，2 mL四氫呋喃，1 mL水，45 ℃下攪拌反應(yīng)6 h后冷卻至室溫，常溫下向反應(yīng)體系中滴加10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的氯化鈉溶液以稀釋反應(yīng)液，用乙醚與二氯甲烷(V乙醚∶V二氯甲烷=4∶1)混合溶液萃取3次，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的氯化鈉洗滌有機(jī)層至中性，無(wú)水硫酸鈉干燥，除去溶劑，柱層析純化(V正己烷∶V乙酸乙酯=4∶1)，旋蒸洗脫液并真空干燥得到淡黃色固體3,8-二甲基-3,5,7-三烯二醛(5)(0.25 g，1.28 mmol)，產(chǎn)率為21.4%。

(3) 2,6,10-三甲基-1,3,5,9-四烯十一烷基膦酸二乙酯(9)的合成：氮?dú)獗Ｗo(hù)下，0 ℃下，取氫化鈉(0.40 g,10 mmol)和15 mL甲苯于200 mL圓底燒瓶中攪拌，將溶于15 mL甲苯中的亞甲基二磷酸四乙酯(2.22 g,7.7 mmol)滴加至反應(yīng)瓶，繼續(xù)攪拌0.5 h。將溶于20 mL甲苯中的6,10-二甲基-十一烷三烯-2-酮(1.48 g,7.7 mmol)滴加至反應(yīng)瓶，繼續(xù)攪拌反應(yīng)0.5 h，室溫反應(yīng)4 h。薄層層析監(jiān)測(cè)(TLC)，待反應(yīng)結(jié)束，向反應(yīng)液中滴加30 mL飽和氯化銨溶液以淬滅反應(yīng)，用20 mL無(wú)水乙醚萃取3次，用飽和氯化鈉洗滌有機(jī)層，減壓除去溶劑，柱層析純化(V正己烷∶V乙酸乙酯=5∶1)，旋蒸洗脫液并真空干燥得到淡黃色液體2,6,10-三甲基-1,3,5,9-四烯十一烷基膦酸二乙酯(9)(1.97 g,6.04 mmol)，產(chǎn)率為78.4%。

圖4 番茄紅素合成路線Figure 4 Synthetic route of lycopene

(4) 番茄紅素(10)的合成：氮?dú)獗Ｗo(hù)下，向50 mL圓底燒瓶中加入叔丁醇鉀(2.53 mL,2.52 mmol)和5 mL四氫呋喃與二甲基亞砜(V四氫呋喃∶V二甲基亞砜=8∶1)混合溶液。反應(yīng)瓶于-30 ℃下攪拌，將溶于5 mL四氫呋喃與二甲基亞砜(V四氫呋喃∶V二甲基亞砜=8∶1)混合溶液的2,6,10-三甲基-1,3,5,9-四烯十一烷基膦酸二乙酯(0.73 g,2.26 mmol)滴至反應(yīng)瓶，攪拌反應(yīng)1 h。將溶于5 mL四氫呋喃與二甲基亞砜(V四氫呋喃∶V二甲基亞砜=8∶1)混合溶液的3,8-二甲基-3,5,7-三烯二醛(0.205 g,1.07 mmol)滴至反應(yīng)瓶中，攪拌反應(yīng)0.5 h，室溫反應(yīng)4 h。用10 mL氯仿萃取反應(yīng)液3次，飽和氯化鈉溶液洗滌有機(jī)層后用無(wú)水硫酸鈉干燥。用二氯甲烷將得到的粗品進(jìn)行重結(jié)晶。75～80 ℃下，將重結(jié)晶得到的產(chǎn)品溶于無(wú)水乙醇中攪拌并冷凝回流1 h。除去溶劑，得到全反式番茄紅素(10)(0.36 g,0.68 mmol)，產(chǎn)率為63.8%。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與表征

2.1.1 2-丁烯-1,4-二磷酸四乙酯(2)結(jié)構(gòu)的鑒定

(1)1H NMR (600 MHz,Chloroform-d)δ5.67～5.38 (m,2H),4.03 (dqt,J=14.1,7.0,3.0 Hz,8H),2.66～2.30 (m,4H),1.24 (t,J=7.1 Hz,12H)。

(2)13C NMR (151 MHz,Chloroform-d)δ123.32,30.02,29.11,15.44。

(3) HRMS(ESI+)m/z：329.127 7。

2.1.2 3,8-二甲基-3,5,7-三烯二醛(5)結(jié)構(gòu)的鑒定

(1)1H NMR (600 MHz,Chloroform-d)δ10.10 (dd,J=49.9,7.8 Hz,2H),6.60 (d,J=15.8 Hz,1H),6.21～6.08 (m,1H),6.05～5.90 (m,2H),3.55～3.34 (m,4H),2.39～2.18 (m,3H),2.17～1.97 (m,3H)。

(2)13C NMR (151 MHz,Chloroform-d)δ190.19,189.05,154.53,150.79,136.66,131.56,129.68,126.35,61.42,57.88,11.95,11.65。

(3) GC-MS(m/z):192,163,148,119,105,91,77,69,51。

2.1.3 2,6,10-三甲基-1,3,5,9-四烯十一烷基膦酸二乙酯(9)結(jié)構(gòu)的鑒定

(1)1H NMR (500 MHz,Chloroform-d)，δ6.75 (dd,J=15.2,11.0 Hz,2H，=CH,=CH),6.16 (d,J=15.1 Hz,1H，=CH),5.93～5.46 (d,J=11.0 Hz，17.3 Hz,1H，=CH),5.14～5.00 (m,1H，=CH),4.06 (p,J=7.2 Hz,4H，2×OCH2),2.23 (d,J=2.7 Hz,3H,CH3),2.12 (d,J=3.3 Hz,4H,2×CH2),1.83 (s,3H,CH3),1.68 (s,3H,CH3),1.60 (s,3H,CH3),1.32～1.26 (d,t,J=7.1 Hz,14.9 Hz,6H,2×CH3)。

(2)13C NMR (126 MHz,Chloroform-d)δ155.57,144.07,133.30,132.00,130.37,124.57,123.60,114.86,61.35,40.23,31.51,29.70,26.50,25.69,17.71,17.13,16.35,15.64。

(3) GC-MS(m/z):326,311,257,229,201,145,119(100%),105,91,69。

2.1.4 番茄紅素(10)結(jié)構(gòu)的鑒定

(1)1H NMR (500 MHz,Chloroform-d)δ6.67～6.59 (m,4H),6.49 (dd,J=15.1,11.0 Hz,2H),6.35 (d,J=14.9 Hz,2H),6.29～6.22 (m,4H),6.18 (d,J=11.5 Hz,2H),5.95 (d,J=10.9 Hz,2H),5.11 (ddq,J=7.1,5.6,1.6 Hz,2H),2.12 (d,J=5.3 Hz,8H),1.97 (s,12H),1.82 (d,J=1.2 Hz,6H),1.69 (s,6H),1.61 (d,J=1.3 Hz,6H)。

(2)13C NMR (126 MHz,Chloroform-d)δ139.50,137.35,136.55,136.17,135.40,132.64,131.75,131.55,130.08,125.72,125.15,124.80,123.95,40.24,26.70,25.71,17.71,16.97,12.91,12.81。

(3) HRMS(ESI+)m/zC40H56：536.436 2。

(4) IR(KBr),vmax：3 433,2 964,2 927,1 720,1 675,1 379,1 095,802 cm-1。

2.2 3,8-二甲基-3,5,7-三烯二醛(5)合成條件的優(yōu)化

2.2.1 堿用量對(duì)化合物5產(chǎn)率的影響 制備含化合物4的混合物的反應(yīng)溶劑為甲苯—環(huán)己烷(V甲苯∶V環(huán)己烷=1∶1)，化合物4制備化合物5的溶劑為4 mL冰乙酸、2 mL 四氫呋喃、1 mL水，n化合物3∶n化合物2為4∶1，水解酸化時(shí)間6 h，分別測(cè)定氫氧化鈉加入量1.4，1.9，2.4，2.9，3.4 g時(shí)化合物5的產(chǎn)率，結(jié)果如表1所示。

Wittig-Horner反應(yīng)中若堿加入量少，則不能良好地將膦酸酯的α-碳進(jìn)行去質(zhì)子化從而生成碳負(fù)離子，降低反應(yīng)效率；若堿加入量過(guò)多，堿性太強(qiáng)，易產(chǎn)生大量縮醛類化合物[27]，副產(chǎn)物增多，產(chǎn)率下降。由表1可知，當(dāng)氫氧化鈉加入量為2.4 g時(shí)，產(chǎn)物5的產(chǎn)率最高，為21.4%。

表1 堿用量對(duì)化合物5產(chǎn)率的影響

當(dāng)氫氧化鈉加入量從1.4 g逐漸增加到2.4 g時(shí)，膦酸酯的α-碳去質(zhì)子化越來(lái)越充分，產(chǎn)率逐漸增加，當(dāng)氫氧化鈉為2.4 g時(shí)產(chǎn)率最高，之后隨著氫氧化鈉加入量的增加，加劇了4,4-二甲氧基-2-丁酮與堿的親核反應(yīng)，副產(chǎn)物增多，產(chǎn)率略有下降。因此，最佳氫氧化鈉加入量為2.4 g。

2.2.2 原料摩爾比對(duì)化合物5產(chǎn)率的影響 制備含化合物4的混合物的反應(yīng)溶劑為甲苯—環(huán)己烷(V甲苯∶V環(huán)己烷=1∶1)，氫氧化鈉2.4 g，反應(yīng)時(shí)間5 h，由化合物4的混合物制備化合物5的溶劑為4 mL冰乙酸、2 mL四氫呋喃和1 mL 水，水解酸化時(shí)間6 h，分別測(cè)定n化合物3∶n化合物2為2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，6∶1時(shí)化合物5的產(chǎn)率，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，當(dāng)n化合物3∶n化合物2由2∶1升至4∶1時(shí)，化合物5的產(chǎn)率由13.2%上升至21.4%。理論上，化合物3與化合物2經(jīng)Wittig-Horner反應(yīng)的n化合物3∶n化合物2為2∶1，但化合物3增加，會(huì)促進(jìn)化學(xué)反應(yīng)的正向進(jìn)行，因此化合物5的產(chǎn)率增加。隨著n化合物3∶n化合物2持續(xù)增加，產(chǎn)率趨于穩(wěn)定，這是因?yàn)檎麄€(gè)反應(yīng)完全，反應(yīng)達(dá)到平衡，所以將n化合物3∶n化合物2控制在4∶1為宜。

2.2.3 水解酸化時(shí)間對(duì)化合物5產(chǎn)率的影響 制備含化合物4的混合物的反應(yīng)溶劑為甲苯—環(huán)己烷(V甲苯∶V環(huán)己烷=1∶1)，氫氧化鈉2.4 g，反應(yīng)時(shí)間5 h，化合物4制備化合物5的溶劑為4 mL冰乙酸、2 mL四氫呋喃、1 mL水和2.4 g氫氧化鈉，n化合物3∶n化合物2為4∶1，測(cè)定酸化時(shí)間分別為2，4，6，8，10 h時(shí)化合物5的產(chǎn)率，結(jié)果如表3所示。

表2 原料摩爾比對(duì)化合物5產(chǎn)率的影響

表3 水解酸化時(shí)間對(duì)化合物5產(chǎn)率的影響

由表3可知，隨著反應(yīng)時(shí)間從2 h延長(zhǎng)至6 h，化合物5 的產(chǎn)率增加，水解酸化6，8，10 h時(shí)化合物5的產(chǎn)率趨于穩(wěn)定，說(shuō)明反應(yīng)時(shí)間為6 h時(shí)反應(yīng)已進(jìn)行完全，考慮時(shí)間成本，水解酸化的最優(yōu)時(shí)間為6 h。

探討以鹽酸替代冰醋酸進(jìn)行酸化，但得到的產(chǎn)物產(chǎn)率較少，顏色較深，顯橙黃色；這可能是由于冰醋酸是中等強(qiáng)度的酸，而鹽酸是強(qiáng)酸，加入量過(guò)多易導(dǎo)致反應(yīng)物炭化，產(chǎn)率降低。

3 結(jié)論

以假性紫羅蘭酮經(jīng)Wittig-Horner反應(yīng)獲得C14膦酸酯(9)，以E-2-丁烯-1,4-二膦酸二乙酯與4,4-二甲氧基-2-丁酮通過(guò)Wittig-Horner反應(yīng)和水解反應(yīng)合成十二碳烯醛(5)，兩化合物通過(guò)Wittig-Horner反應(yīng)、異構(gòu)化反應(yīng)制備全反式番茄紅素。結(jié)果表明，試驗(yàn)設(shè)計(jì)的以十二碳烯醛(5)為核心的合成路線是可行的。與現(xiàn)有的工藝相比，基于十二碳烯醛的制備為特征的合成路線；有效地將工業(yè)中產(chǎn)率低且昂貴的十碳烯醛替換成原料廉價(jià)易得，“一鍋法”合成的十二碳烯醛(5)。番茄紅素總體合成步驟短，反應(yīng)產(chǎn)率為16.7%，有潛在的開發(fā)前景。