張曉燕 吳子健 陸健康 侯惠靜 柳昊杰 孟令莉 趙穎濤

(1. 天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134；2. 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843399；3. 天津天獅學(xué)院食品工程學(xué)院，天津 301700；4. 天津商業(yè)大學(xué)藝術(shù)學(xué)院，天津 300134)

肝臟是肉制品加工后廉價(jià)的副產(chǎn)物，含有大量的蛋白質(zhì)和豐富的營(yíng)養(yǎng)元素，如：氨基酸、礦物質(zhì)和脂肪酸等[1-2]。由于缺乏對(duì)羊肝蛋白質(zhì)功能特性的研究，使得其利用局限于肝醬制品和動(dòng)物飼料。與雞肝和豬肝相比，羊肝中不僅含有豐富的微量元素(如Cu、Fe)和必需脂肪酸(如γ-亞麻酸)，而且含有大量維生素和蛋白質(zhì)(17.90 g/100 g·羊肝)[3-4]，使得其具有抗氧化、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、抗腫瘤以及提高機(jī)體免疫力等功能[5]。目前有關(guān)羊肝的研究基本集中在產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和工藝優(yōu)化等方面，例如：韓志慧等[6]將利用發(fā)酵和脫膻法去除了膻味羊肝與具有明目功效的營(yíng)養(yǎng)液混合，研制得到了新型的羊肝羹；李黎等[7]研制和開(kāi)發(fā)了具有明目功效的羊肝口服液，并對(duì)其工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化；張宇[8]優(yōu)化了羊肝蛋白的提取工藝，并考察其抗氧化活性；文飛[9]優(yōu)化了羊肝蛋白多肽的制備工藝，并考察其抗氧化活性，未見(jiàn)NaCl含量對(duì)羊肝中不同蛋白組分功能特性影響的報(bào)道。

試驗(yàn)擬研究羊肝蛋白的穩(wěn)定性及NaCl含量對(duì)水溶性羊肝蛋白(Water soluble liver proteins，WSLP)和鹽溶性羊肝蛋白(Salt soluble liver proteins，SSLP)的乳化性、起泡性，以及其分子量分布和表面疏水性，以期為羊肝蛋白的加工利用提供數(shù)據(jù)支持與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料前處理

選取新鮮美利奴羊羊肝，手工除去血管和脂肪組織，然后分割成300 g左右的組織塊，真空包裝后，貯存于-40 ℃ 下直至分析。

1.2 試劑

磷酸氫二鈉、氯化鈉：分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；

磷酸二氫鈉：分析純，天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；

十二烷基硫酸鈉：分析純，天津博迪化工股份有限公司；

三(羥甲基)氨基甲烷：分析純，上海山浦化工有限公司；

考馬斯亮藍(lán)G-250：分析純，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

高壓均質(zhì)機(jī)：AH100B型，加拿大ATS公司；

納米粒度分析儀：Zetasizer Nano-ZS 90型，英國(guó)Malvern公司；

離心機(jī)：3-18K型，德國(guó)Sigma公司；

真空冷凍干燥機(jī)：日本EYELA公司；

熒光分光光度計(jì)：FL970型，香港Techcomp公司；

垂直電泳系統(tǒng)：SE 260型，美國(guó)Hoefer公司；

超微量紫外分光光度計(jì)：NanoPhotometer-N50型，德國(guó)IMPLEN公司；

凝膠成像系統(tǒng)：Essential V6型，英國(guó)Uvitec公司；

差示掃描量熱儀(DSC)：STA 449F3型，耐馳科學(xué)儀器有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 羊肝基礎(chǔ)指標(biāo)的測(cè)定

(1) 羊肝粗蛋白含量：凱氏定氮法[10]。

(2) 脂肪含量：索氏提取法[11]。

1.4.2 羊肝蛋白提取 取冷凍羊肝4 ℃下過(guò)夜放置融化后組織研磨，加入4倍體積的4 ℃的0.05 mol/L磷酸鈉鹽緩沖液(pH 7.4)，室溫下振蕩提取30 min后，于4 ℃離心(10 000×g)15 min，收集上清液，沉淀重復(fù)上述提取步驟兩次，合并3次提取的上清液即為WSLP水溶液；取提取WSLP的沉淀加入4倍體積0.60 mol/L NaCl溶液(0.05 mol/L、pH 7.4的磷酸鈉緩沖液)，按上述步驟提取合并上清液即為SSLP溶液；所得WSLP溶液和SSLP溶液置于4 ℃下透析(透析膜的分子截留量為8 000～13 000 kDa) 48 h[12]。

1.4.3 十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 參照文獻(xiàn)[13]，具體參數(shù)：分離膠12%、濃縮膠5%、樣品蛋白質(zhì)量濃度1.5 mg/mL，上樣量7 μL，電壓200 V、電泳時(shí)間40 min左右。

1.4.4 熱穩(wěn)定性 根據(jù)李艷青[14]的方法采用差示掃描量熱儀(DSC)測(cè)定。稱取5～8 mg蛋白樣品于鋁盒中，使用空置鋁盒作為空白。設(shè)置參數(shù)為：測(cè)定溫度20～150 ℃，加熱速度10 ℃/min，采用pyris6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

1.4.5 蛋白粒徑及Zeta電位的測(cè)定 采用納米粒徑分析儀測(cè)定，設(shè)置參數(shù)為：蛋白質(zhì)量濃度1 mg/mL；使用配有He/Ne激光器，λ=633 nm。

1.4.6 表面疏水性的測(cè)定 取4.0 mL蛋白溶液(質(zhì)量濃度范圍為0.01～0.05 mg/mL)加入20 μL的8.0 mmol/L ANS試劑，室溫下反應(yīng)1.0 min后測(cè)定其熒光吸收值，熒光分光光度計(jì)設(shè)備參數(shù)為：激發(fā)波長(zhǎng)370 nm、發(fā)射波長(zhǎng)490 nm、夾縫5 nm、掃描速率60 nm/s。以未加ANS的蛋白溶液為空白，然后以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，蛋白濃度為橫坐標(biāo)作圖，其斜率即可反映蛋白質(zhì)的表面疏水性(Ho)[15]。

1.4.7 乳化性(EAI)及乳化穩(wěn)定性(ESI)的測(cè)定 提取的羊肝蛋白溶于NaCl溶液中至蛋白質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，并以4∶1(V羊肝蛋白鹽溶液∶V大豆油)的比例加入大豆油，均質(zhì)(轉(zhuǎn)速為10 000 r/min)1 min立即從底部取100 μL均質(zhì)后溶液，并加入10.0 mL十二烷基硫酸鈉溶液(0.1%、pH 7.0)，混合均勻，測(cè)定500 nm下的吸光度記為A0，10 min 后，重復(fù)之前操作，測(cè)定吸光度，記為A10。分別按式(1)和式(2)計(jì)算乳化性指數(shù)(Emulsifying activity index，EAI)、乳化穩(wěn)定性指數(shù)(Emulsifying stability index，ESI)[16-17]。

(1)

(2)

式中：

IEA——乳化性指數(shù)，m2/g；

IES——乳化穩(wěn)定性指數(shù)，min；

φ——油相體積分?jǐn)?shù)(油的體積/乳化體系的體積)，25%；

C——樣品蛋白質(zhì)含量，mg/mL；

A0、A10——乳化體系在0，10 min時(shí)的吸光度；

N——稀釋倍數(shù)，100。

1.4.8 起泡性(FA)及泡沫穩(wěn)定性(FS)的測(cè)定 使用NaCl溶液調(diào)節(jié)蛋白溶液的質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL，記錄起始溶液體積為V0，以10 000 r/min均質(zhì)2 min，測(cè)量蛋白溶液和泡沫的總體積，計(jì)為V1，30 min后，再次測(cè)量蛋白溶液和泡沫的總體積，計(jì)為V2。分別按式(3)、(4)計(jì)算起泡性(Foaming activity，F(xiàn)A)、泡沫穩(wěn)定性(Foaming stability，F(xiàn)S)[18]。

(3)

(4)

式中：

AF——起泡性，mL/g；

SF——泡沫穩(wěn)定性，%；

V0——初始時(shí)的液面高度，cm；

V1——均質(zhì)后的液面高度，cm；

V2——靜置30 min后的液面高度，cm。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，每次試驗(yàn)測(cè)定3個(gè)平行樣，結(jié)果用SPSS 25.0進(jìn)行分析處理(P<0.05)，數(shù)據(jù)作圖采用OriginPro8.1軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肝蛋白的基本表征

經(jīng)試驗(yàn)測(cè)定，羊肝中的粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.76%，其中WSLP的蛋白質(zhì)純度達(dá)到90.528%，SSLP的蛋白質(zhì)純度達(dá)到70.564%，脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.19%。

2.2 SDS-PAGE電泳

如圖1所示：以Mark為參照，WSLP包含各種高分子量和低分子量的蛋白質(zhì)，在20～100 kDa的低分子量范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)多個(gè)條帶，主要的蛋白條帶分別為34，46，52，63，77 kDa。肌漿蛋白是分子量相對(duì)較低的水溶性球狀蛋白，主要由糖酵解途徑的酶，肌酸激酶和血紅素色素組成[19]。WSLP的SDS-PAGE圖中還顯示了幾種高分子量蛋白質(zhì)，其中主要蛋白質(zhì)約為110 kDa，它們可能是成肌纖維的片段[20]。

SSLP的SDS-PAGE圖譜中顯示出高分子量和低分子量的蛋白質(zhì)。主要的蛋白條帶分別為72，63，60，42，101 kDa，然而，與WSLP相比，在低分子量范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)較少的蛋白質(zhì)條帶，而在高分子量范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)較多的蛋白質(zhì)條帶，SSLP的分子量分布與Nuckles等[21]的研究相似。Steen等[22]將42 kDa的弱條帶認(rèn)為是肌動(dòng)蛋白條帶，試驗(yàn)也具有相似推斷。WSLP和SSLP的SDS-PAGE圖譜中有相似分子量的譜帶，可能是由蛋白質(zhì)在磷酸鹽和NaCl磷酸鹽溶液中的部分溶解性所致，也可能是存在具有相同分子量的不同蛋白質(zhì)[23]。

2.3 熱穩(wěn)定性

由圖2可知，WSLP和SSLP的變性溫度分別在74.4 ℃ 和87.9 ℃左右，SSLP的熱穩(wěn)定性高于WSLP。

2.4 羊肝蛋白的粒徑和Zeta電位

由圖3(a)可知，WSLP的粒徑在100～1 000 nm處有較為集中的分布。而SSLP的分別在0～100，100～1 000 nm 出現(xiàn)分布，其中在100～1 000 nm出現(xiàn)的單峰，與WSLP的粒徑分布很相似。

圖1 鹽溶性與水溶性羊肝蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜Figure 1 The image of protein gel electrophoresis

圖2 羊肝蛋白的DSC分析曲線Figure 2 DSC analysis curve of sheep liver protein

圖3 羊肝蛋白的粒徑和電位分析圖Figure 3 Particle size and potential analysis of sheep liver protein

由圖3(b)可知，SSLP的Zeta電位總數(shù)高于WSLP的，靜電相互作用較強(qiáng)，表明SSLP可能更加穩(wěn)定。

2.5 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)羊肝蛋白表面疏水性的影響

由表1可知：當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0%～3.6%時(shí)，WSLP和SSLP兩類(lèi)蛋白的表面疏水性會(huì)隨NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高而增加；未添加NaCl時(shí)，WSLP的表面疏水性較SSLP低，而NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.8%和3.6%時(shí)WSLP的表面疏水性卻明顯高于SSLP，說(shuō)明NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)WSLP蛋白表面疏水性的影響程度較SSLP的要大。WSLP主要為各種肌漿球蛋白，特別是肌球蛋白相關(guān)蛋白，鹽離子的添加會(huì)使得原本處于蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基的側(cè)鏈逐漸暴露于蛋白的外部[24]。帶負(fù)電荷的Cl-會(huì)削弱水分子與蛋白分子間的氫鍵，促進(jìn)水分的遷移，進(jìn)而影響溶液體系中水分的分布；同時(shí)Cl-會(huì)與肌漿球蛋白絲中帶正電荷的氨基酸殘基側(cè)鏈結(jié)合，削弱原有蛋白分子內(nèi)的離子鍵，改變蛋白結(jié)構(gòu)，促使蛋白分子中疏水基團(tuán)暴露于蛋白的表面，進(jìn)而增加其表面疏水性[25]。另外，SSLP主要為各種肌原纖維蛋白，而通常NaCl會(huì)促進(jìn)SSLP各蛋白質(zhì)的溶解，Thawornchinsombut等[26]研究結(jié)果表明魚(yú)的肌原纖維蛋白在NaCl濃度低于0.6 mol/L (3.5%)時(shí)，蛋白的表面疏水性沒(méi)有顯著變化，當(dāng)NaCl濃度高于0.6 mol/L時(shí)，其表面疏水性顯著增加。

2.6 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)羊肝蛋白乳化性與乳化穩(wěn)定性的影響

由圖4(a)可知：WSLP和SSLP乳化性隨NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.0%～3.6%)的增加而降低；未添加NaCl以及NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.8%時(shí)，WSLP的乳化性均明顯高于SSLP，而NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.6%時(shí)，WSLP的表面疏水性略低于SSLP，說(shuō)明NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)WSLP乳化性的影響較SSLP的大。

表1 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)WSLP和SSLP蛋白表面疏水性的影響

小寫(xiě)字母不同表示同一蛋白源不同鹽濃度間差異顯著(P<0.05)；大寫(xiě)字母不同表示同一鹽濃度不同蛋白源間差異顯著(P<0.05)圖4 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)羊肝蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響Figure 4 Effect of NaCl concentration on emulsification and emulsification stability of sheep liver protein

由圖4(b)可知：不添加NaCl時(shí)，WSLP的乳化穩(wěn)定性高于SSLP；而NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1.8%和3.6%時(shí)，WSLP的乳化穩(wěn)定性比SSLP的低。這是由于能夠遷移到油水界面的蛋白質(zhì)量降低或蛋白質(zhì)從界面向連續(xù)相的擴(kuò)散增加導(dǎo)致的，與靜電、水合排斥和界面上吸附的蛋白分子之間的空間相互作用有關(guān)[27]。Silva等[28]觀察到，隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.0%～1.6%)增加乳液的乳化性降低，可能是由于乳液形成后蛋白質(zhì)從界面到連續(xù)相的擴(kuò)散增加。Khalid等[29-30]認(rèn)為NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí)(0.2%～1.0%)鷹嘴豆和芝麻籽乳化能力的提高，是因?yàn)槿芙舛鹊奶岣?，而在較高的鹽離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)下(1.2%～2.0%)乳化能力的降低，是由于鹽析效應(yīng)。

2.7 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)羊肝蛋白起泡性與泡沫穩(wěn)定的影響

由圖5可知：NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0%～3.6%時(shí)，WSLP和SSLP的起泡性和泡沫穩(wěn)定性均呈先增加后降低的趨勢(shì)。當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.8%時(shí)，WSLP和SSLP的起泡性和泡沫穩(wěn)定性顯著增加，因?yàn)榇藭r(shí)兩種蛋白的表面疏水性增加(如表1所示)，蛋白質(zhì)在空氣/水界面處的相互作用增強(qiáng)，但當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.6%時(shí)，WSLP和SSLP的起泡性顯著下降，是因?yàn)槭杷园被釟埢蛲獠靠臻g暴露太多時(shí)，蛋白質(zhì)分子間疏水相互作用增強(qiáng)，進(jìn)而發(fā)生凝聚導(dǎo)致產(chǎn)生空氣與水界面蛋白薄膜的蛋白量減少，引發(fā)起泡性下降，如Zouari等[31]研究結(jié)果顯示添加1%的NaCl可提高火雞肝臟蛋白的起泡性，而當(dāng)NaCl添加量為2%時(shí)，起泡性顯著降低。Zou等[32]研究表明起泡性和泡沫穩(wěn)定性會(huì)影響肝醬產(chǎn)品的加工及貯藏。

小寫(xiě)字母不同表示同一蛋白源不同鹽濃度間差異顯著(P<0.05)；大寫(xiě)字母不同表示同一鹽濃度不同蛋白源間差異顯著(P<0.05)圖5 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)羊肝蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響Figure 5 Effect of NaCl concentration on foaming property and foam stability of sheep liver protein

3 結(jié)論

經(jīng)提取后的羊肝中含有90.528%的水溶性蛋白和70.564%的鹽溶蛋白。水溶性羊肝蛋白的十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜以低分子量為主，而鹽溶性羊肝蛋白在高分子量范圍的條帶較多。羊肝鹽溶蛋白的熱穩(wěn)定性較高，且粒徑分布也較為集中，說(shuō)明鹽溶蛋白的穩(wěn)定性較高，電位分析也可驗(yàn)證這一結(jié)果。添加NaCl可顯著降低羊肝水溶蛋白和鹽溶蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性，而起泡性和泡沫穩(wěn)定性發(fā)生顯著的先增加后降低的趨勢(shì)。