徐正賢，江 潔，羅灶霞，李江山，周鑫媛，龍發(fā)宗，向太和

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311121)

溫郁金(CurcumawenyujinY.H. ChenetC. Ling)是姜科姜黃屬植物，其塊根加工成的藥材“溫郁金”為浙江省道地藥材“浙八味”之一[1].根據(jù)藥用部位與加工方法的不同，可分別加工成3種不同藥材：塊根煮熟曬干稱“溫郁金”，側(cè)根莖縱切厚片曬干稱“片姜黃”，主根莖煮熟曬干稱“溫莪術(shù)”.3種藥材均為2010年版《中國(guó)藥典》收載品種，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2].迄今，已從溫郁金中分離獲得82種化學(xué)成分，包括單萜類、倍半萜類、二萜類、生物堿等[3-8].蓬莪術(shù)環(huán)二烯，作為溫郁金根莖揮發(fā)油的主要成分之一，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有抑制作用[9-10].特別是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，從溫郁金中分離的β-欖香烯表現(xiàn)出高效低毒的抗腫瘤活性，具有增加誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，對(duì)肺癌、肝癌、腦癌、食道癌、胃癌和骨轉(zhuǎn)移癌等多種癌癥安全有效[11-13].據(jù)此已研制出療效好、副作用小的新型抗腫瘤藥物，開(kāi)發(fā)出具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗腫瘤植物藥物[14].此外，溫郁金在抗炎、鎮(zhèn)痛方面具有顯著療效，還具有保肝、抗憂郁作用以及抗血栓和改善血液循環(huán)等功效[15-16].

溫郁金主要以根莖繁殖，易感染病毒，且受到多種病蟲(chóng)害的危害.由于其長(zhǎng)期的無(wú)性繁殖，導(dǎo)致種群退化、病毒化嚴(yán)重，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì)，難以得到安全、有效、穩(wěn)定、可控的溫郁金藥材[17].為了提純復(fù)壯溫郁金資源，快速繁殖獲得良種，通過(guò)植物組織培養(yǎng)技術(shù)建立溫郁金快速高效的繁殖體系非常必要.目前雖然有個(gè)別報(bào)道利用組織培養(yǎng)獲得了溫郁金的再生植株，但由于直接以塊根作為外植體，外植體嚴(yán)重帶菌，導(dǎo)致外植體消毒不徹底、培養(yǎng)過(guò)程中污染嚴(yán)重、再生植株頻率低等問(wèn)題[18-20].另一方面，毛狀根(hairy roots)是發(fā)根農(nóng)桿菌所含Ri質(zhì)粒的T-DNA片段在植物細(xì)胞基因組DNA中插入、整合并表達(dá)，誘導(dǎo)植物細(xì)胞形成的不定根.在應(yīng)用上，毛狀根具有天然植物根的結(jié)構(gòu)、能夠在不含有植物激素的培養(yǎng)基上快速生長(zhǎng)，且遺傳穩(wěn)定性高并能合成和積累植物次生代謝物質(zhì).因此，毛狀根可作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)植物的藥用活性成分[21-22].根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌的侵染，在一些藥用植物中實(shí)現(xiàn)了毛狀根的誘導(dǎo)，并從毛狀根中分離獲得多種藥用活性成分，如：丹參[23]、人參[24]、絞股藍(lán)[25]、紅豆杉[26]、長(zhǎng)春花[27]、金鐵鎖[28]、三葉青[29]和溫山藥[30]等.本研究在實(shí)現(xiàn)溫郁金高效再生的基礎(chǔ)上，利用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染外植體成功誘導(dǎo)獲得毛狀根.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

溫郁金實(shí)生苗原種由浙江省溫州市天禾生物科技有限公司惠贈(zèng)，實(shí)生苗種植在杭州師范大學(xué)人工氣候室.選取長(zhǎng)勢(shì)良好、無(wú)病蟲(chóng)害的溫郁金葉、莖作為組培的外植體.同時(shí)，利用健壯的塊根，埋入泥炭∶蛭石=4∶1(v/v)配比的培養(yǎng)土中，保持培養(yǎng)土濕潤(rùn)，20—25 ℃條件下生長(zhǎng)30—40 d，待塊根長(zhǎng)出1—1.5 cm長(zhǎng)的芽尖，從塊根上端0.1—0.2 cm處剪取芽尖作為組培的外植體.誘導(dǎo)毛狀根的外植體來(lái)源于無(wú)菌苗.

1.2 外植體消毒

外植體用含0.1%洗潔精的自來(lái)水浸泡清洗10 min，再用自來(lái)水漂洗3次，最后在消毒液中浸泡5-50 min.消毒后的外植體用無(wú)菌的雙蒸餾水沖洗3次.實(shí)驗(yàn)使用的消毒液有0.1%升汞水溶液、3.0%雙氧水和6.0%次氯酸鈉水溶液(即稀釋5倍的市售安替福民).

1.3 外植體培養(yǎng)

消毒后的外植體接種至誘導(dǎo)叢生芽的培養(yǎng)基，即含6-BA(6-芐基腺嘌呤)2 mg/L+IAA (吲哚乙酸)1 mg/L+ZT(玉米素)1 mg/L+Cef(頭孢霉素)500 mg/L的MS培養(yǎng)基.在20—25 ℃、光照1 000—1 200 Lux條件下培養(yǎng)，獲得叢生芽.獲得的叢生芽切割為帶頂芽的個(gè)體，接種至生根培養(yǎng)基，即含6-BA 0.5 mg/L+ 0.5 mg/L IAA的MS培養(yǎng)基.在20—25 ℃、光照1 000—1 200 Lux下培養(yǎng)15—20 d，形成帶根的完整植株.

1.4 發(fā)根農(nóng)桿菌K599侵染液制備

將-80℃保存的野生型發(fā)根農(nóng)桿菌K599在LB + 50 mg/L Str(鏈霉素)固體培養(yǎng)基上劃線、28℃暗培養(yǎng)2 d.取單菌落于LB + 50 mg/L Str液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，28 ℃、200 r/min.當(dāng)農(nóng)桿菌菌液光密度OD值約為1.0時(shí)，取1 mL菌液于1.5 mL離心管中，離心、除上清；用MS液體培養(yǎng)基懸浮菌體，離心、除上清；再用MS液體培養(yǎng)基稀釋至OD值約為0.1，用作侵染液.

1.5 溫郁金毛狀根的誘導(dǎo)和繁殖

在超凈工作臺(tái)上，剪取約長(zhǎng)×寬約2×1 cm的葉片、長(zhǎng)1—2 cm的莖、約1 cm3球形塊根、同時(shí)帶1—2 cm長(zhǎng)莖和約1 cm3塊根的根莖段作為農(nóng)桿菌侵染的外植體.在每個(gè)葉片上剪出2—3個(gè)傷口，用無(wú)菌的解剖針在莖段和根上刺出5—10個(gè)傷口.帶傷口的外植體，放入培養(yǎng)皿中，加入適量侵染菌液，覆蓋外植體，置于搖床上、90 r/min侵染10 min后取出，用無(wú)菌蒸餾水清洗3次，再用無(wú)菌濾紙吸干外植體表面液體，置于MS+NAA 0.4 mg/L+As(乙酰丁香酮) 20 mg/L培養(yǎng)基中，20—25 ℃、遮光培養(yǎng).2—3 d后，將外植體取出，轉(zhuǎn)入MS+Cef 500 mg/L液體培養(yǎng)基中，100 r/min振蕩除菌10 min，再用無(wú)菌濾紙將外植體表面液體吸干，轉(zhuǎn)入MS+NAA 0.4 mg/L+Cef 500 mg/L培養(yǎng)基中，20—25 ℃、遮光培養(yǎng)，每周更換一次培養(yǎng)基.待誘導(dǎo)出的毛狀根長(zhǎng)至3 cm左右，剪下置于B5+KT 1 mg/L+IBA 1 mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)繁殖.

1.6 毛狀根的分子鑒定

利用生工公司植物基因組DNA提取試劑盒提取毛狀根和組培苗根的基因組DNA.根據(jù)發(fā)根農(nóng)桿菌K599 Ri質(zhì)粒pRi2659 T-DNA上rolB序列(GenBank：EF433766)設(shè)計(jì)引物5’-GCCAGCATTTTTGGTGAACT-3’和5’-CTGGCCCATCGTTCTAAAAA-3’，利用PCR擴(kuò)增儀對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，按94 ℃變性45 s、55 ℃退火45 s、72 ℃延伸90 s的程序進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后在72 ℃下延伸10 min結(jié)束反應(yīng).擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳1 h (5 V/cm)，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)觀察和拍照記錄.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒劑對(duì)溫郁金外植體消毒的效果

不同消毒劑對(duì)溫郁金葉、莖和根的消毒效果差異明顯(表1).其中，0.1%升汞水溶液處理外植體20 min消毒效果最佳.

表1 不同方法對(duì)外植體消毒的效果Tab.1 Results of explant contamination by different disinfection methods

2.2 外植體的消毒方法對(duì)叢生芽的影響

0.1%升汞水溶液消毒20 min以及稀釋5倍的安替福民消毒的外植體均出現(xiàn)黃化枯死；而0.1%升汞水溶液消毒10 min的莖尖端培養(yǎng)，能較好分化出芽叢(表2).為此，選擇0.1%升汞10 min的滅菌方法，利用芽尖段作為外植體，做進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn).在接種的100個(gè)芽尖端外植體中，全部無(wú)污染.培養(yǎng)3—5 d，芽尖靠基部的區(qū)段可見(jiàn)有膨大萌動(dòng)；15—20 d可見(jiàn)分化出小的芽叢.所有接種的莖尖端外植體均能全部再分化出芽叢，芽的再生率可達(dá)100%.培養(yǎng)25—30 d后，形成大量的芽叢.將再生的芽生叢切割后，轉(zhuǎn)入MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中，再經(jīng)過(guò)15—20 d，可獲得含粗壯根系的完整植株.洗除植株根的基部培養(yǎng)基，移栽至培養(yǎng)土中，散射光下10 d后轉(zhuǎn)入室外，在自然條件下生長(zhǎng)能獲得健壯的實(shí)生苗(圖1).

表2 不同消毒方法以及不同外植體再分化結(jié)果Tab.2 Results of redifferentiation of different explants with different disinfection methods

A:接種的芽尖段;B:芽尖誘導(dǎo)出的叢生芽;C:移栽到盆缽中組培苗;D:移栽成活的組培苗

2.3 毛狀根的誘導(dǎo)和繁殖

發(fā)根農(nóng)桿菌K599侵染葉片后，培養(yǎng)過(guò)程中葉片逐漸變黃，未能誘導(dǎo)出毛狀根；侵染莖后20 d左右，在莖的下端會(huì)長(zhǎng)出毛狀的不定根，誘導(dǎo)率為35.6%(16/45)；侵染塊根后20 d左右，在根的傷口處長(zhǎng)出絨狀的不定根，誘導(dǎo)率為30%(6/20)；侵染根莖段后20 d左右，在根和莖端均可誘導(dǎo)出不定根，誘導(dǎo)率可達(dá)75%(15/20)(圖2).待毛狀根長(zhǎng)至3 cm左右，剪下置于繁殖培養(yǎng)基中能進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育.

2.4 毛狀根的分子鑒定

M:DS2000 DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量;1:普通組培苗的根;2:發(fā)根農(nóng)桿菌K599菌液;3—6:從根莖上誘導(dǎo)的毛狀根

鑒于根莖段誘導(dǎo)毛狀根的誘導(dǎo)率最高，選用rolB基因引物對(duì)根莖段誘導(dǎo)的毛狀根進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，能從誘導(dǎo)的毛狀根中擴(kuò)增出大小約700 bp的特征條帶，而溫郁金組培苗的根，則無(wú)條帶(圖3).進(jìn)一步說(shuō)明，誘導(dǎo)出的不定根為毛狀根.

3 討論

通過(guò)植物組織培養(yǎng)技術(shù)可為提純復(fù)壯溫郁金提供資源，實(shí)現(xiàn)快速繁殖獲得良種.汪洪等和王曉慧等分別報(bào)道以溫郁金的主根莖和根莖上大約0.5 cm的芽作為外植體，通過(guò)愈傷組織的誘導(dǎo)和再分化獲得了再生植株[18-19].呂德任等利用剝離的溫郁金莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)作為外植體，污染少；但采用其他的外植體，則污染率極高[20].本研究通過(guò)剪取塊根上的芽尖端作為外植體，用0.1% HgCl2消毒外植體，外植體無(wú)污染情況出現(xiàn)；而且，外植體可以直接再生叢生芽，芽的再生率可達(dá)100%.本研究提供了一種無(wú)污染、高效的快速繁殖溫郁金的方法，克服了目前溫郁金組織培養(yǎng)污染嚴(yán)重、再生頻率低等問(wèn)題，在生產(chǎn)實(shí)踐中有利于溫郁金的品種改良.

另一方面，毛狀根可以作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用成分，可實(shí)現(xiàn)在發(fā)酵罐中工廠化培養(yǎng)繁殖[21-22].本研究利用發(fā)根農(nóng)桿菌K599侵染溫郁金的莖、根以及根莖段，均成功誘導(dǎo)出了毛狀根，其中，根莖段的誘導(dǎo)毛狀根的頻率較高，初步建立了毛狀根誘導(dǎo)的技術(shù)體系.因此，利用溫郁金的毛狀根，可望實(shí)現(xiàn)工廠化生長(zhǎng)并提取溫郁金抗癌藥用成分β-欖香烯等.由發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的毛狀根中β-欖香烯含量如何？如何實(shí)現(xiàn)溫郁金毛狀根在發(fā)酵罐中的大量繁殖、以及如何從毛狀根中高效提純藥用成分，尚待進(jìn)一步分析和研究.