孔令偉,呂憲寶

膀胱癌(bladder cancer,BCa)又稱膀胱尿路上皮癌,多發(fā)于男性,位居男性腫瘤發(fā)病率的第9位,死亡率的第8位[1-2]。臨床上BCa復(fù)發(fā)率很高,膀胱癌細胞遷移侵襲肌層、膀胱周圍組織或血管,嚴重影響B(tài)Ca轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后[3-4]。因此探究影響膀胱癌細胞增殖、侵襲和遷移的新靶點,對于臨床上治療BCa意義重大。人微小核糖核酸(microRNA,miRNA)可與mRNA結(jié)合,從而參與調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡等進程[5]。miR-145具有抑癌作用,影響腫瘤侵襲和增殖,研究表明,miR-145在膀胱癌組織中下調(diào),抑制膀胱癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,但是關(guān)于miR-145調(diào)控膀胱癌細胞增殖、侵襲和遷移的相關(guān)機制不明[6]。鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子5(zinc finger protein transcription factor 5,KLF5)廣泛表達在人體不同組織中,高表達時有助于腫瘤增殖、侵襲和遷移,是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因子[7]。在BCa中,miR-145能否通過靶向調(diào)控KLF5,進而抑制膀胱癌細胞增殖、侵襲、遷移尚不清楚,因此本研究測定miR-145 mimic轉(zhuǎn)染后BIU-87細胞miR-145、KLF5及相關(guān)蛋白表達水平,分析其對BIU-87細胞增殖、侵襲、遷移的影響,探究調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

RMPI 1640培養(yǎng)液(貨號:31800)、特級胎牛血清(貨號:S9000)、總RNA提取試劑盒(貨號:R1200)、RP1100通用RT-PCR試劑盒(貨號:RP1100)均購自北京索萊寶科技有限公司;兔抗人KLF5(貨號:FNab04600)、兔抗人PI3K(貨號:FNab09857)、兔抗人PCNA(貨號:FNab06215)、兔抗人MMP-9(貨號:FNab05247)、兔抗人MMP-2(貨號:FNab05238)、兔抗人E-cadherin(貨號:FNab02617)、羊抗兔二抗(貨號:FNSA-0015)均購自武漢菲恩生物科技有限公司;兔抗人AKT(貨號:K10080-ZRF)、兔抗人p-AKT(貨號:K10770-IZK)均購自北京百奧萊博科技有限公司;miR-145mimic、miR-145陰性對照序列購自上海生工生物公司;VeritiTMPCR儀購自美國賽默飛世爾科技公司;BMM-300型正置三目金相顯微鏡購自上海巴拓儀器有限公司;ZF-388型全自動凝膠成像分析系統(tǒng)購自上海嘉鵬科技有限公司。

1.2 細胞系和轉(zhuǎn)染

正常膀胱組織細胞系(SV-HUC-1)和膀胱癌細胞系(BIU-87)均購自中科院上海細胞庫。用含有10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng),隔天換液,在37 ℃、5%CO2,相對濕度98%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至貼壁面積占培養(yǎng)皿的80%～90%,胰酶消化傳代,取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。將BIU-87細胞以1×105個/孔接種到24孔板上,待BIU-87細胞密度在50%融合狀態(tài)時棄去培養(yǎng)液,更換成opti-RMPI 1640,根據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作,分別轉(zhuǎn)染miR-144無規(guī)則序列、miR-145 mimics序列。實驗分組:①對照組(轉(zhuǎn)染時加入等量培養(yǎng)液后的BIU-87細胞);②miR-145陰性對照組(轉(zhuǎn)染miR-144無規(guī)則序列后的BIU-87細胞);③miR-145 mimic組(轉(zhuǎn)染miR-145 mimics序列后的BIU-87細胞);④SV-HUC-1細胞作為SV-HUC-1組。轉(zhuǎn)染6 h后終止轉(zhuǎn)染操作,更換成完全培養(yǎng)液繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)BIU-87細胞,24 h后收集細胞,熒光顯微鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)染效率。

1.3 RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染后BIU-87細胞miR-145表達水平

收集SV-HUC-1細胞和轉(zhuǎn)染后BIU-87細胞,加入Trizol試劑以提取各組細胞中總RNA,按照說明構(gòu)建PCR反應(yīng)體系20 μl。PCR擴增條件:95 ℃預(yù)變性300 s,95 ℃變性30 s,65 ℃退火60 s,72 ℃延伸30 s,共進行40個循環(huán),75 ℃終末延伸5 min。miR-145上游引物序列:5′-CGCGCTCGAGCCCAGAGCAATAAGCCACAT-3′,下游引物序列:5′-GGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3′;內(nèi)參U6上游引物序列:5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′,下游引物序列:5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。設(shè)置6個復(fù)孔,采用2-ΔΔCT法對miR-145表達水平進行定量分析。

1.4 蛋白印跡法(Western blotting,WB)測定轉(zhuǎn)染后BIU-87細胞KLF5、PI3K、AKT、p-AKT、PCNA、MMP-9、MMP-2、E-cadherin表達水平

加入100 μl含有苯甲基磺酰氟(PMSF)的細胞裂解液,充分裂解細胞,刮鏟收集蛋白,使用BCA試劑盒測定總蛋白含量,10 μl緩沖液混合(按照每4 μl蛋白樣品加入1 μl蛋白上樣緩沖液(5×)的比例,混合均勻后100 ℃預(yù)處理10 min,50 μg/孔上樣,凝膠電泳分離目標蛋白,80 V 30 min,120 V 90 min,電泳,濕法轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉后,以1∶1 000的稀釋比例加入一抗,4 ℃下孵育過夜,PBS洗滌3次,以1∶1 000的稀釋比例加入二抗,室溫雜交1 h,PBS洗滌3次,ECL法顯色,測定條帶灰度值,蛋白相對含量=目標蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.5 MTT法測定轉(zhuǎn)染后BIU-87細胞活性

按照分組設(shè)置6個復(fù)孔,用RMPI 1640培養(yǎng)液調(diào)整BIU-87細胞密度,以1×104個/孔種到96孔板上,常規(guī)培養(yǎng)48 h,之后加入25 μl MTT溶液(5 mg/ml),繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)4 h,棄培養(yǎng)液,加入DMSO溶液150 μl,恒溫振蕩器震蕩10 min(37 ℃,100 rpm),用多功能酶標儀測定各孔樣品在490 nm處吸光度(OD值)。計算轉(zhuǎn)染后的BIU-87細胞活性,BIU-87細胞活性(%)=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.6 Transwell小室侵襲實驗測定轉(zhuǎn)染后BIU-87細胞侵襲能力

用RMPI 1640培養(yǎng)液稀釋Matrigel基質(zhì)膠(20 μg/μl),隨后50 μl稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠加入到Transwell板上室中,37 ℃放置3 h,之后在超凈臺上風(fēng)干使其凝聚成人工基底膜。按照分組在設(shè)置的6個復(fù)孔上室加入轉(zhuǎn)染后的BIU-87細胞(200 μl,5×105個/孔),下室加入600 μl RMPI 1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)48 h,用鑷子取出Transwell小室,用棉簽擦拭基底膜細胞,雙蒸水漂洗3次,甲醇固定15 min,結(jié)晶紫(0.1%)染色15 min,雙蒸水漂洗3次,分別選取上、下、左右、中五個視野計數(shù),結(jié)果取平均值。

1.7 劃痕實驗測定轉(zhuǎn)染后BIU-87細胞體外遷移能力

按照分組設(shè)置6個復(fù)孔,用RMPI 1640培養(yǎng)液調(diào)整BIU-87細胞密度,以5×105個/孔接種到6孔板上,培養(yǎng)箱培養(yǎng),待細胞密度平鋪6孔板底部約80%時,用滅菌后的200 μl槍頭垂直于孔板,輕劃出細胞劃痕,每孔劃4～5條平行劃痕,PBS清洗3次。加入無血清RMPI 1640培養(yǎng)液,培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,培養(yǎng)結(jié)束后用甲醇固定15 min,光學(xué)顯微鏡觀察并拍照,計算BIU-87細胞遷移能力,BIU-87細胞遷移能力(%)=(初始兩側(cè)距離-觀察時兩側(cè)距離)/初始兩側(cè)距離×100%。

1.8 雙熒光素酶實驗檢測miR-145與KLF5靶標關(guān)系

1.8.1 熒光素酶報告實驗突變型載體的制備 生物學(xué)信息網(wǎng)站TargetScan分析KLF5序列3′端非編碼區(qū)域(3′UTR)區(qū)域存在1個miR-145結(jié)合位點,根據(jù)熒光素酶報告基因質(zhì)粒pMIR構(gòu)建KLF5 3′UTR熒光素酶報告基因質(zhì)粒。pMIR質(zhì)?？寺〗吧?KLF5-wt)和突變型(KLF5-mt)的3′UTR下游位點。

1.8.2 熒光素酶測試報告實驗 用RMPI 1640培養(yǎng)液調(diào)整BIU-87細胞密度,以1×104個/孔種到96孔板,培養(yǎng)過夜后,用LipofectamineTM2000將miR-145陰性對照與KLF5-野生型(wt)、miR-145 mimic與KLF5-野生型(wt)或KLF5-突變型(mt)共轉(zhuǎn)染,設(shè)置6個復(fù)孔,轉(zhuǎn)染24 h后,100 μl/孔加入Dual-GLO? Substrate/Buffer,15 min后測定吸光度,之后100 μl/孔加入stop &glo?Substrate/Buffer,10 min后測定吸光度,熒光素酶的相對活性以前后熒光強度比值表示。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率

熒光場下可見miR-145陰性對照組和miR-145 mimics組BIU-87細胞呈明顯綠色熒光,對照組無熒光,說明轉(zhuǎn)染成功。經(jīng)白場和熒光場對比觀察,BIU-87細胞轉(zhuǎn)染效率達到85%,可用于后續(xù)實驗,見圖1。

1A:對照組;1B:miR-145陰性對照組;1C:miR-145 mimics組圖1 BIU-87細胞轉(zhuǎn)染情況(×200)

2.2 不同細胞中miR-145、KLF5、PI3K、AKT、p-AKT表達水平

與SV-HUC-1細胞組相比,BIU-87細胞對照組miR-145表達水平明顯降低(P<0.05),AKT表達水平無明顯變化(P>0.05),KLF5、PI3K表達水平和p-AKT水平顯著升高(P<0.05);與對照組、miR-145陰性對照組相比,miR-145 mimics組miR-145表達水平顯著升高(P<0.05),AKT表達水平無明顯變化(P>0.05),KLF5、PI3K表達水平和p-AKT水平明顯降低(P<0.05),見圖2和表1。

2A:SV-HUC-1細胞組;2B:對照組;2C:miR-145陰性對照組;2D:miR-145 mimics組圖2 不同細胞中KLF5、PI3K、AKT、p-AKT表達水平

表1 不同細胞中miR-145、KLF5、PI3K、AKT、p-AKT表達水平

2.3 miR-145 mimic轉(zhuǎn)染后BIU-87細胞活性

與對照組相比,miR-145mimics組細胞活性明顯降低(P<0.05),miR-145陰性對照組BIU-87細胞活性無明顯變化(P>0.05),見圖3。

注:與對照組相比,*P<0.05;與miR-145陰性對照組相比,#P<0.05圖3 miR-145 mimic轉(zhuǎn)染后BIU-87細胞活性

2.4 miR-145 mimic轉(zhuǎn)染后BIU-87細胞侵襲能力

與對照組相比,miR-145mimics組BIU-87細胞通過Matrigel到達濾膜底層的細胞數(shù)明顯減少(P<0.05),miR-145陰性對照組細胞數(shù)無明顯變化(P>0.05),見圖4和圖5。

4A:對照組;4B:miR-145陰性對照組;4C:miR-145 mimics組圖4 miR-145 mimic轉(zhuǎn)染后BIU-87細胞侵襲能力(×100)

2.5 miR-145 mimic轉(zhuǎn)染后BIU-87細胞遷移能力

與對照組相比,miR-145 mimics組BIU-87細胞體外遷移能力明顯降低(P<0.05),miR-145陰性對照組BIU-87細胞體外遷移能力無明顯變化(P>0.05),見圖6和圖7。

2.6 miR-145 mimic轉(zhuǎn)染后BIU-87細胞PCNA、MMP-9、MMP-2、E-cadherin表達水平

與對照組、miR-145陰性對照組相比,miR-145 mimics組PCNA、MMP-9、MMP-2表達水平明顯降低(P<0.05),E-cadherin表達水平顯著升高(P<0.05),見圖8和表2。

表2 miR-145 mimic轉(zhuǎn)染后BIU-87細胞PCNA、MMP-9、MMP-2、E-cadherin表達水平

注:與對照組相比,*P<0.05;與miR-145陰性對照組相比,#P<0.05圖5 miR-145 mimic轉(zhuǎn)染后BIU-87細胞侵襲能力

6A:對照組;6B:miR-145陰性對照組;6C:miR-145 mimics組圖6 miR-145 mimic轉(zhuǎn)染后BIU-87細胞遷移能力(×100)

2.7 miR-145與KLF5靶標關(guān)系

Targetscan分析表明,miR-145序列3′UTR區(qū)存在1個KLF5結(jié)合位點。熒光素酶報告實驗顯示,與pMIR-KLF5-mt+miR-145陰性對照組比較,KLF5-wt+miR-145 mimic組的熒光素酶相對活性顯著升高(P<0.05)而pMIR-KLF5-mt+miR-145 mimic組的熒光素酶相對活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖9和表3。

表3 BIU-87細胞熒光素酶的相對活性

注:與對照組相比,*P<0.05;與miR-145陰性對照組相比,#P<0.05圖7 miR-145 mimic轉(zhuǎn)染后BIU-87細胞遷移能力

8A:對照組;8B:miR-145陰性對照組;8C:miR-145 mimics組圖8 miR-145 mimic轉(zhuǎn)染后BIU-87細胞PCNA、MMP-9、MMP-2、E-cadherin表達水平

3 討論

miR-145具有組織特異性、時序性、保守性的特點,作為抑癌基因參與調(diào)控腫瘤細胞增殖、分化[8]。本研究發(fā)現(xiàn),與SV-HUC-1細胞組相比,BIU-87細胞對照組miR-145表達水平明顯降低,提示在BIU-87細胞中miR-145低表達,其抑癌功能受到抑制。miR-145在大鼠腦動脈血管平滑肌(VSMC)細胞中低表達,上調(diào)miR-145表達水平,可靶向抑制MMP-9 表達水平,從而抑制VSMC細胞遷移、增殖[9]。膀胱癌T24細胞中miR-145低表達,上調(diào)miR-145表達水平后,能夠抑制PLCε、N-cadherin、V-cadherin表達,促進E-cadherin表達,從而降低T24細胞遷移能力[6]。本研究發(fā)現(xiàn),miR-145 mimics組miR-145表達水平較對照組、miR-145陰性對照組顯著升高,說明miR-145 mimic轉(zhuǎn)染成功,miR-145表達水平上調(diào)。與對照組、miR-145陰性對照組相比,miR-145 mimics組細胞活性、侵襲能力、遷移能力明顯降低,說明上調(diào)miR-145表達水平能夠抑制BIU-87細胞增殖、遷移、侵襲,但是miR-145調(diào)控何種信號通路參與此進程還有待研究。

9A:pMIR-KLF5-wt+miR-145陰性對照;9B:miR-145 mimic+KLF5-wt;9C:miR-145 mimic+KLF5-mt圖9 miR-145 mimic與KLF5-wt或KLF5-mt共轉(zhuǎn)染后BIU-87細胞圖

KLF5能夠參與腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移進程[10]。KLF5直接與TNFAIP2基因啟動子結(jié)合并激活其轉(zhuǎn)錄,可通過調(diào)控Rac1和Cdc42促進乳腺癌細胞的增殖,遷移和侵襲[11]。本研究發(fā)現(xiàn),與SV-HUC-1細胞組相比,BIU-87細胞對照組KLF5表達水平顯著升高,提示KLF5與膀胱癌有關(guān),可能參與其發(fā)生發(fā)展進程。石東亮等[12]研究發(fā)現(xiàn),KLF5是miR145潛在結(jié)合位點,上調(diào)miR145表達水平能夠靶向下調(diào)KLF5表達水平,從而抑制K1細胞侵襲和增殖。本研究發(fā)現(xiàn),與對照組、miR-145陰性對照組相比,KLF5表達水平明顯降低,TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示miR-145序列3′UTR區(qū)存在1個KLF5結(jié)合位點,雙熒光素酶實驗證實KLF5是miR-145作用靶點,說明上調(diào)miR-145表達水平可能靶向調(diào)控KLF5表達,從而抑制BIU-87細胞增殖、遷移和侵襲。

PI3K/AKT信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展和腫瘤細胞增殖、凋亡進程中發(fā)揮重要作用[13]。夏迎晨等[14]研究發(fā)現(xiàn),miR-145能夠抑制PI3K/AKT和MAPK信號通路活性,從而降低肺癌A549細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力。本研究發(fā)現(xiàn),與SV-HUC-1細胞組相比,BIU-87細胞對照組PI3K表達水平和p-AKT水平顯著升高,提示在BIU-87細胞中PI3K/AKT信號通路激活,促進細胞增殖、遷移和侵襲。與對照組、miR-145陰性對照組相比,miR-145 mimic組PI3K表達水平和p-AKT水平明顯降低,說明上調(diào)miR-145水平能夠抑制PI3K/AKT信號通路活性,降低細胞增殖、遷移和侵襲能力。PCNA能夠反映細胞增殖活性,PCNA表達水平增加,說明細胞增殖活性強,沉默PCNA基因表達可上調(diào)Caspase-3、Bax表達,下調(diào)Bcl-2表達,從而抑制甲狀腺癌細胞的增殖、促進凋亡[15]。MMP-9和MMP-2類屬于鋅依賴性蛋白水解酶,能夠降解細胞外基底膜和基質(zhì),促進細胞侵襲和遷移[16]。E-cadherin是癌細胞侵襲和黏附能力的重要標記物,上調(diào)E-cadherin白表達表達水平,下調(diào)Vimentin和N-cadherin表達水平,能夠緩解EMT誘導(dǎo)膀胱癌轉(zhuǎn)移[17]。本研究發(fā)現(xiàn),miR-145 mimics組PCNA、MMP-9、MMP-2表達水平較對照組、miR-145陰性對照組相比顯著降低,E-cadherin表達水平顯著升高,提示miR-145可靶向下調(diào)KLF5表達水平,阻斷PI3K/AKT信號通路活性,下調(diào)PCNA、MMP-9、MMP-2表達水平,上調(diào)E-cadherin表達水平,從而抑制BIU-87細胞增殖、遷移和侵襲能力。

綜上所述,在BIU-87細胞中,miR-145低表達,KLF5高表達,miR-145可靶向調(diào)控KLF5,可能通過阻斷PI3K/AKT信號通路活性,抑制BIU-87細胞增殖、遷移和侵襲能力。但具體如何調(diào)控信號通路還有待進一步研究。