范夢科，張奇，陳偉，楊偉杰，齊莉莉，王玲

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是好發(fā)于青少年的惡性骨腫瘤，約占原發(fā)骨腫瘤的36%[1]。雖然OS治療手段大幅提升，患者術(shù)后生存期延長，但仍有超過30%的病例出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[2-4]。因而，尋找新的治療方法以進(jìn)一步改善OS患者預(yù)后極其重要。近年來，靶向治療廣泛應(yīng)用于腫瘤領(lǐng)域，它可直接抑制致癌基因或分子，抑制腫瘤的惡性進(jìn)展。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)是腫瘤免疫的主要成分。T細(xì)胞是主要抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞，它接受來自抗原提呈細(xì)胞 (antigen presenting cell，APC)和腫瘤細(xì)胞等共刺激信號(hào)，發(fā)生激活或抑制[5-7]。研究表明，T細(xì)胞常接受抑制信號(hào)，造成功能弱化，使腫瘤逃脫免疫系統(tǒng)監(jiān)視[8-9]。例如，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T-regulatory cells，Tregs)可通過CTLA-4結(jié)合效應(yīng)T細(xì)胞表面B7-1和B7-2，抑制效應(yīng)T細(xì)胞[10]，而其他成員B7-H1、B7-DC、B7-H3等亦對效應(yīng)T細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用。本文就B7家族分子在OS中的表達(dá)、調(diào)節(jié)與治療的研究進(jìn)展進(jìn)行綜合性論述。

1 B7家族在原發(fā)性O(shè)S中的表達(dá)及意義

1.1 B7-H1 B7-H1又稱程序性死亡配體1(programmed death ligand 1，PD-L1)，PD-L1是Dong等[11]發(fā)現(xiàn)的B7家族第三個(gè)成員，與T細(xì)胞活化相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，B7-H1介導(dǎo)的T細(xì)胞免疫反應(yīng)具有雙向性：當(dāng)CD28分子不參與共刺激時(shí)，B7-H1提供正性共刺激的第二信號(hào)，促進(jìn)T細(xì)胞活化；當(dāng)T細(xì)胞從CD3和CD28獲得信號(hào)而劇烈增殖時(shí)，B7-H1與T細(xì)胞的PD-1受體結(jié)合使之抑制[12]。一般情況下，B7-H1表達(dá)在多種細(xì)胞上，如APC，活化的T、B細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)和內(nèi)皮細(xì)胞等[13-16]。同樣，PD-1亦可表達(dá)在多種免疫細(xì)胞，如B細(xì)胞、激活的單核細(xì)胞、浸潤的T細(xì)胞等[17-19]。B7-H1在腫瘤細(xì)胞上高表達(dá)時(shí)，它將使腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞群體受到抑制。

近年的研究已檢測到PD-L1在肝癌[20]、食管癌[21]和白血病[22]等腫瘤組織中表達(dá)，并與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[12]。高表達(dá)PD-L1預(yù)示患者臨床預(yù)后不良。在一項(xiàng)69例OS組織免疫組化研究中，測得PD-L1陽性率為43.5%，其表達(dá)影響患者的生存時(shí)間(P<0.001)[23]。Koirala等[24]研究發(fā)現(xiàn)，25%的原發(fā)OS表達(dá)PD-L1，當(dāng)與表達(dá)PD-1免疫細(xì)胞共存時(shí)，其表達(dá)大幅度影響患者的生存率，表明OS細(xì)胞表達(dá)PD-L1對表達(dá)PD-1的免疫細(xì)胞有大幅度抑制作用。在體外研究中，敲除OS細(xì)胞系(KHOS)PD-L1基因，OS細(xì)胞生物學(xué)特性減弱，并且對化療藥物反應(yīng)增強(qiáng)[25]。對比OS患者與正常人的外周血，發(fā)現(xiàn)在OS患者中檢測到以輔助性CD4+T細(xì)胞為主的IL-21表達(dá)降低，而PD-1高水平[26]。OS細(xì)胞表達(dá)PD-L1可抑制輔助性CD4+T細(xì)胞IL-21分泌和增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞IFN-γ分泌的功能[26]。PD-L1表達(dá)受到了多種方式的調(diào)節(jié)作用。組蛋白脫乙?；?histone deacetylase，HDAC)可參與癌癥基因表達(dá)、細(xì)胞增殖、凋亡等諸多過程。當(dāng)敲除OS細(xì)胞系HDAC6后,STAT3激活增加，PD-L1上調(diào),而抑制HDAC6，PD-L1表達(dá)則恢復(fù)[27]。Nie等[28]敲除OS細(xì)胞系(U20S)的STAG2(Stromal Antigen 2)后，得到了相同的效果。在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)中，微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一重要的群體。在一項(xiàng)熒光素酶報(bào)告基因研究中，miR-140可與mRNA 3’UTR結(jié)合而抑制PD-L1生成，同時(shí)其下游mTOR增殖信號(hào)減弱。重要的是，高表達(dá)miR-140使CD8+T細(xì)胞、骨髓來源的抑制性細(xì)胞(Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)增加，而Tregs細(xì)胞減少。進(jìn)一步研究顯示，miR-140可以抑制有免疫力的C57BL/6J鼠腫瘤生長，而裸鼠不受影響[29]。然而，miRNA也可間接抑制PD-L1的表達(dá)，它可先作用于PTEN調(diào)節(jié)PD-L1轉(zhuǎn)錄效率[30]。綜上所述，PD-L1表達(dá)涉及到包括DNA、RNA和蛋白質(zhì)等多水平多過程的調(diào)控，因此，免疫治療必須明確各調(diào)控層面的主次作用，才能更有效地抑制腫瘤。

目前，PD-1/PD-L1軸的靶向治療已經(jīng)應(yīng)用于臨床，并獲得良好的療效。然而研究發(fā)現(xiàn)，PD-1/PD-L1軸靶向藥物與其他治療的聯(lián)合應(yīng)用能獲得更好的效果。SDF-1/CXCR4軸是促進(jìn)MDSCs在OS微環(huán)境積累的一個(gè)重要因素。當(dāng)聯(lián)合應(yīng)用CXCR4拮抗劑AMD3100與PD-1/PD-L1抗體治療OS小鼠模型時(shí)，腫瘤生長速度減緩[26]。PI3Kδ/γ是一個(gè)可致外周血中MDSCs急劇增加的分子[31]。Shi等[32]聯(lián)合PI3Kδ/γ特異性抑制劑(SNA)和PD-1抗體治療OS小鼠模型，也發(fā)現(xiàn)了小鼠腫瘤生長減緩且生存延長。所以，MDSCs對于OS的免疫抑制作用可作為一個(gè)關(guān)鍵的聯(lián)合靶。共刺激分子和化療聯(lián)合治療對改善OS的生長也達(dá)到了上述效果，如Tim-3、PD-L1和OX-86三種抗體聯(lián)合應(yīng)用使OS轉(zhuǎn)移發(fā)生率大幅降低[33-35]。OS致病的多因性決定了其治療的綜合性，從整體范圍抑制OS的發(fā)展是未來OS治療的一個(gè)重要方向。然而，多數(shù)研究尚且處于實(shí)驗(yàn)探究階段，還需要更多的臨床研究驗(yàn)證。

1.2 B7-DC B7-DC又稱為PD-L2,PD-L2的結(jié)構(gòu)與B7-H1類似，它的受體也是PD-1[36]。PD-L2表達(dá)于樹突狀細(xì)胞和活化巨噬細(xì)胞[37]，幾乎不表達(dá)在其他正常組織。研究表明，PD-1與PD-L2結(jié)合抑制了T細(xì)胞的增殖、分泌和死亡。目前，PD-L2/PD-1在OS中僅有1篇相關(guān)性研究[38]。研究者行免疫組化染色測得PD-L2在原發(fā)OS中高表達(dá)，敲除OS細(xì)胞的PD-L2，其下游RhoA-ROCK-LIMK2信號(hào)失活，抑制了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，使OS細(xì)胞遷移和侵襲能力削弱。在進(jìn)一步的體內(nèi)研究中，將敲除PD-L2的OS細(xì)胞注射入小鼠體內(nèi)后，發(fā)現(xiàn)敲除PD-L2的OS細(xì)胞很少轉(zhuǎn)移到肺部。該研究首先證明了PD-L2在OS中的表達(dá)特點(diǎn)和其對下游調(diào)節(jié)的基本機(jī)制。當(dāng)然，還需要大量的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步證明。

1.3 B7-H3 B7-H3是Chapoval等[39]在人類的cDNA文庫中首先發(fā)現(xiàn)的，由于結(jié)構(gòu)類似B7家族,因此命名為B7-H3。研究發(fā)現(xiàn)，B7-H3 mRNA可表達(dá)在人類正常組織，如：上皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等[40-41]。B7-H3蛋白腫瘤組織中的表達(dá)更為廣泛。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)B7-H3蛋白在多種癌組織中高表達(dá),包括肝癌[42]、肺癌[43]、前列腺癌[44]、腎癌[45]、乳腺癌[46]、食管癌[47]等，并與腫瘤的惡性度和患者不良預(yù)后密切相關(guān)。

B7-H3在OS的表達(dá)明顯高于PD-L1，并與患者的生存期有密切的聯(lián)系。Wang等[48]分析了61例原發(fā)性O(shè)S患者的病理組織，發(fā)現(xiàn)B7-H3的陽性率高達(dá)91.8%(P<0.001)，相應(yīng)的，患者生存和復(fù)發(fā)時(shí)間均縮短；同時(shí)，在高表達(dá)B7-H3的腫瘤組織中，檢測到少量的CD8+T細(xì)胞，說明OS細(xì)胞表達(dá)B7-H3可能對免疫功能有抑制作用。在建立的OS小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性O(shè)S的B7-H3呈過表達(dá)型，并具高侵襲性[49]。過表達(dá)的miR-124直接結(jié)合B7-H3 mRNA，抑制其翻譯，而沉默miR-124可削弱OS細(xì)胞的增殖與侵襲[50]。另外，hsa_circ0021347作為一種環(huán)狀RNA分子亦能影響B(tài)7-H3的表達(dá)。在生物信息學(xué)分析中，Wang等[51]觀察到miR-646和hsa-miR-1205同時(shí)參與并促進(jìn)OS的發(fā)展。在外周血中，同樣檢測到OS患者的B7-H3水平明顯升高，并與腫瘤臨床分期、轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后有很大的相關(guān)性[52]。然而，目前B7-H3表達(dá)調(diào)節(jié)的研究還比較局限，有待進(jìn)一步研究擴(kuò)展，如表觀遺傳學(xué)、通路蛋白的調(diào)節(jié)作用等。嵌合抗原受體(CAR)T細(xì)胞是通過靶向分子受體對T細(xì)胞的修飾使得T細(xì)胞獲得更為精準(zhǔn)的腫瘤識(shí)別功能，同時(shí)可激活自身，從而更有效地殺滅腫瘤細(xì)胞。研究表明，CAR T細(xì)胞在治療復(fù)發(fā)性小兒急性淋巴細(xì)胞白血病中已顯示出巨大療效[53]。在OS中，Gardner等[54]開發(fā)的一種B7-H3 CAR T細(xì)胞，通過治療OS小鼠模型，發(fā)現(xiàn)它可使腫瘤大幅減小。因此，B7-H3 CAR T細(xì)胞有可能成為未來OS治療的一個(gè)方向。

1.4 B7-H4 B7-H4是2003年利用生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)的免疫細(xì)胞活化協(xié)同刺激因子[55]。B7-H4蛋白在腎、乳腺和胃腫瘤中表達(dá)，負(fù)性調(diào)控T細(xì)胞，可使T細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞因子減少并誘導(dǎo)其凋亡，促進(jìn)腫瘤發(fā)展[56-59]。B7-H4在OS中也有很高的陽性表達(dá)。Dong等[60]對比104例OS患者與健康人的B7-H4表達(dá)情況，檢測到有70.19%腫瘤組織表達(dá)B7-H4，OS患者外周血B7-H4水平明顯高于健康人，且OS組織和血清的B7-H4高水平與腫瘤分期及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，與患者的生存時(shí)間聯(lián)系緊密；單因素分析顯示，腫瘤分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤組織和血清B7-H4表達(dá)水平與總體患者生存率相關(guān)；多因素分析表明，腫瘤分期、腫瘤組織和血清B7-H4表達(dá)水平是獨(dú)立預(yù)后因素。所以，進(jìn)一步探索OS的B7-H4表達(dá)的調(diào)節(jié)因素意義重大，極有可能成為OS免疫治療的新靶點(diǎn)，外周血中B7-H4的濃度可做為OS診斷特異指標(biāo)。

2 B7家族在轉(zhuǎn)移性O(shè)S中的表達(dá)及意義

共刺激分子過度表達(dá)是OS轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)，過表達(dá)共刺激分子將進(jìn)一步抑制腫瘤微環(huán)境的免疫成分，導(dǎo)致OS轉(zhuǎn)移的發(fā)生。Sundara等[61]在對臨床標(biāo)本的免疫組化分析中，檢測到48%的轉(zhuǎn)移性O(shè)S組織高表達(dá)PD-L1，而OS早期高表達(dá)PD-L1將很大程度上促進(jìn)OS的轉(zhuǎn)移(P=0.011)[62]。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，PD-L1表達(dá)水平對OS轉(zhuǎn)移具有預(yù)測價(jià)值[63]。與原發(fā)OS相比，PD-L2在轉(zhuǎn)移性O(shè)S中也呈過表達(dá)[38]。所以，高水平的PD-L1與PD-L2可能是OS轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。同樣，在免疫靶向治療的研究中發(fā)現(xiàn)，PD-1抗體使OS肺轉(zhuǎn)移小鼠的生存時(shí)間延長，肺轉(zhuǎn)移瘤減小，NK和巨噬細(xì)胞的浸潤程度增加[64]。而聯(lián)合性治療將進(jìn)一步增強(qiáng)抗OS的效果。將放療與PD-1聯(lián)合治療OS轉(zhuǎn)移瘤小鼠時(shí)，出現(xiàn)了更明顯的腫瘤消除效應(yīng)[65]。Lussier等[66]應(yīng)用PD-L1和CTLA-4抗體聯(lián)合治療轉(zhuǎn)移性O(shè)S小鼠，也出現(xiàn)了上述的效果。因此，靶向治療PD-L1/PD-1在原發(fā)與轉(zhuǎn)移性O(shè)S小鼠模型均具有良好的療效，尤其是聯(lián)合PD-L1/PD-1與其他免疫靶向治療或輔助治療，將進(jìn)一步消滅腫瘤，增加荷瘤小鼠的生存時(shí)間。在對轉(zhuǎn)移性O(shè)S的研究中,免疫組化檢測到B7-H3在晚期肺轉(zhuǎn)移OS中過表達(dá)，B7-H4過表達(dá)與OS患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[60]。目前，共刺激分子在轉(zhuǎn)移性O(shè)S的研究還較少，但其在OS轉(zhuǎn)移中的地位相當(dāng)重要，尤其是B7-H3與B7-H4，極有可能成為OS免疫治療的新突破點(diǎn)。

3 展望

目前研究表明，PD-L1/PD-1、PD-L2、B7-H3和B7-H4在骨肉瘤的進(jìn)展中發(fā)揮重要的作用，對患者預(yù)后有較好的預(yù)測。靶向PD-L1/PD-1軸治療獲得了較好的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，尤其與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用比單一PD-L1/PD-1抗體治療更有優(yōu)勢。B7-H3和B7-H4表達(dá)與OS進(jìn)展亦有密切聯(lián)系，并且明顯影響患者的生存時(shí)間。然而，對B7-H3和B7-H4的研究還處于起步階段，其表達(dá)與調(diào)節(jié)機(jī)制還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證，兩者在外周血中的表達(dá)濃度可作為OS診斷的特異分子。