佟廣香，唐國盤，董 樂，張慶漁，張永泉，匡友誼

(1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江省冷水性魚類種質資源及增養(yǎng)殖重點開放實驗室，哈爾濱 150070；2.河南牧業(yè)經濟學院動物科技學院，鄭州 450046；3.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306)

哲羅魚(Huchotaimen)屬鮭形目鮭科哲羅魚屬，是鮭科魚類中生長最快的冷水性魚類，其肉質細嫩，味道鮮美，營養(yǎng)豐富[1]。目前哲羅魚的野生資源十分匱乏，已被IUCN列為瀕危物種紅色名錄，處于易危狀態(tài)[2,3]。魚類生長與水溫密切相關，低于或高于魚類的適宜生長水溫時，就會妨礙魚類的正常生長發(fā)育[4]。超出適宜生長溫度可使魚類的攝食量[5]、飼料報酬[6]、抗病力[7]和繁殖率[8]等生產指標顯著降低，甚至導致魚類大量死亡。哲羅魚是典型的冷水性魚類，對溫度變化敏感，最適生長水溫為15.0～18.0 ℃，當水溫在12.0～18.0 ℃時，哲羅魚生長速度隨水溫的升高而加快，18.0 ℃時達到頂峰[9]；水溫超過18.0 ℃時，哲羅魚生長速度隨水溫的升高而降低，甚至死亡。由于水溫的限制，在集約化網箱養(yǎng)殖過程中，夏季高溫極易引起哲羅魚應激反應，造成減產，甚至全部死亡[10]；水溫限制也使哲羅魚的養(yǎng)殖區(qū)域僅分布在我國東北和西北地區(qū)[11]，而我國北方水資源并不豐富，且冰封期較長、生長期短等因素導致哲羅魚的養(yǎng)殖周期較長，生長優(yōu)勢不明顯。選擇高溫耐受的哲羅魚新品種能夠在南方推廣養(yǎng)殖，延長生長期，縮短養(yǎng)殖周期，已成為哲羅魚養(yǎng)殖面臨的一個難題。目前哲羅魚的馴化養(yǎng)殖及人工繁育已經取得成功[12,13]，溫度對哲羅魚幼魚生長及攝食效率的影響也有報道[14]，但未有高溫脅迫的相關研究。本實驗模擬自然狀態(tài)下哲羅魚的生存環(huán)境，采取緩慢升溫的方式將水溫升至26.0 ℃并保持96 h，探討哲羅魚在26.0 ℃時血細胞組成、血清生化指標及相關熱應激蛋白基因的變化規(guī)律，弄清哲羅魚處于高溫時的生理變化，以期為哲羅魚高溫耐受相關研究提供理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試哲羅魚由中國水產科學研究院黑龍江水產研究所渤海冷水性魚試驗站提供，隨機選取健康的2齡哲羅魚50尾，平均體重(128.0±12.0) g。將試驗魚移入控溫魚缸，每天投喂2次，水溫(18.0±0.2) ℃，暫養(yǎng)20 d，待試驗魚適應環(huán)境后開始升溫，每24 h升高1.0 ℃，升至(26.0±0.2) ℃維持96 h。分別于18.0 ℃和26.0 ℃的 0、24、48、96 h采樣。取樣前將試驗魚麻醉，每組取10尾，抽取2 mL血液，用于血細胞組成分析和血清分離；采集肝臟、心臟和血液RNA樣本儲存-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 血細胞組成及血清生化指標的測定

用動物血液細胞分析儀(邁瑞B(yǎng)C-2800Vet)測定白細胞總數、紅細胞數、淋巴細胞數、中性粒細胞數、單核細胞數、血紅蛋白含量和血小板數。用全自動血液生化指標分析儀(邁瑞B(yǎng)S200)測定肝功能相關指標：總膽紅素(T-bil-V)、白蛋白(ALB)、天門冬氨酸氨基轉移酶(又稱谷草轉氨酶,AST)、堿性磷酸酶(ALP)和總蛋白(TP)；血脂類：總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)；腎功能相關指標：肌酐(CREA-S)和二氧化碳(CO2)；心臟功能：肌酸激酶(CK)。

1.3 RNA提取及qPCR擴增

Trizol法提取總RNA，并用反轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA。本實驗室對目前常用的10個內參基因(28SrRNA、gapdh、arbpr、18SrRNA、rps29、rpl13、rpl19、sdha、α-tublin和β-actin) 穩(wěn)定性分析發(fā)現，在哲羅魚的血液、心、腦和肝組織內，rpl13、rpl19和rps29均表現很好的穩(wěn)定性，可以做RT-qPCR的內參基因(未發(fā)表)，本實驗選擇rpl19基因作為內參基因。利用primer 5.0設計hsp60、hsp70、hsp90和rpl19基因特異性擴增引物(表1)。反應體系為10 μL，包括SYBR Green Mix 5 μL，c DNA 1 μL，10 pmol/μL的上下游引物各1 μL，ddH2O 2 μL。擴增程序為 95 ℃預變性30 s，95 ℃ 15 s，60.5 ℃ 20 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60.5 ℃ 1 min，95 ℃ 1 min。

1.4 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 血細胞組成

血細胞數量的變化見表2，由表2可知白細胞和血小板的數量未發(fā)生顯著性變化；紅細胞數均顯著高于對照組，并隨著時間的增加而增加，96 h達極顯著水平；淋巴細胞數在0、24和48 h時顯著高于對照組，96 h極顯著高于對照組；中性粒細胞數均顯著低于對照組；單核細胞表現出下降趨勢，在96 h顯著低于對照組；血紅蛋白在24 h的含量極顯著高于對照組，在48 h與96 h顯著高于對照組。此外值得注意的是在溫度升至26.0 ℃后，隨著時間的增加，淋巴細胞、中性粒細胞和血紅蛋白在26.0 ℃不同時間點無顯著性差異。

表2 高溫脅迫下哲羅魚血細胞數目Tab.2 Blood cell count of H.taimen under high temperature stress

2.2 血清生化指標變化

血清生化指標變化見表3，肝功能相關指標：總膽紅素(T-bil-V)和白蛋白(ALB)與對照組無顯著性差異；總蛋白(TP)呈現上升趨勢，96 h顯著高于對照組；谷草轉氨酶(AST)先下降后上升，0 h極顯著低于對照組，其余組別與對照組無顯著差異；堿性磷酸酶(ALP)先上升后下降，0～48 h顯著高于對照組，96 h下降至與對照組無顯著差異。血脂類：低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)與對照組無顯著性差異；總膽固醇(TC)呈現上升趨勢，96 h顯著高于對照組。腎功相關指標：肌酐(CREA-S)先下降、后上升、再下降，0 h顯著低于對照組，24 h與對照組無顯著差異，48 h時顯著高于對照組；二氧化碳(CO2)呈現下降趨勢，96 h時顯著低于對照組。心臟功能：肌酸激酶(CK)先下降、后上升，均顯著低于對照組。

表3 高溫脅迫下哲羅魚血清生化指標Tab.3 Serum biochemical indexes of H.taimen under high temperature stress

2.3 相關基因的表達

血液中hsp70和hsp90基因表達量與對照組無顯著差異，hsp60基因呈現上升趨勢，24～96顯著高于對照組。心臟和腦組織中hsp70與對照組無顯著差異，hsp60和hsp90基因表現出先上升后下降的趨勢，24 h和96 h極顯著高于對照組。肝臟中hsp60基因表達與對照組無顯著差異，hsp70和hsp90基因低于對照組，部分時間點達到顯著水平，hsp90基因在肝臟中最先表現出極顯著差異具體見圖1。

3 討論

紅細胞和血紅蛋白與魚體內氧的供應直接相關[15]，哲羅魚在水溫升至26.0 ℃時，紅細胞即發(fā)生顯著性增加，且隨時間的延長紅細胞數目持續(xù)顯著增加，這是由于溫度升高時，水中溶解氧含量降低，哲羅魚活動性增強，魚體耗氧量增加，需要改變呼吸頻率來增加氧攝入，同時增加紅細胞的數量和血紅蛋白的含量，相應提升結合氧能力[16]，來維持機體的耗氧。哲羅魚用增加紅細胞數目和血紅蛋白含量來維持高溫下魚體耗氧，這與羅非魚(Oreochromsmossambcus)、丁(Tincatinca)的研究結果一致[17]。除了紅細胞和血紅蛋白發(fā)生變化外，淋巴細胞、中性粒細胞和單核細胞也發(fā)生了變化。淋巴細胞、中性粒細胞和單核細胞均是與魚體的免疫相關的細胞，魚類處于系統發(fā)育較低階段，淋巴細胞主要具有吞噬細菌、病毒的作用；中性粒細胞和單核細胞屬于非特異免疫系統，中性粒細胞具趨化作用、吞噬作用和殺菌作用；單核細胞能吞噬、清除受傷、衰老的細胞及其碎片，非特異性免疫系統在抵抗病原生物入侵時發(fā)揮著重要作用。有研究表明，應激對魚類吞噬細胞的數量有顯著影響，各種功能受到抑制[18]。本試驗高溫脅迫過程中，淋巴細胞含量均顯著高于對照組，中性粒細胞和單核細胞低于對照組與文獻報道一致[18]，說明以淋巴細胞為主的免疫系統正在積極的發(fā)揮作用，而非特異免疫功能受到抑制，這些免疫相關的細胞發(fā)生變化，說明26.0 ℃水溫超出魚體適應范圍，魚體極其不適應，魚體處于感染狀態(tài)。

圖1 哲羅魚熱應激蛋白相關基因的表達Fig.1 Expression of heat shock protein genes of H.taimen

T-bil-V反映肝臟的分泌和排泄功能，TP和ALB反應肝臟合成儲存功能，肝臟也是合成和存儲總膽固醇(TC)的主要器官，本實驗中T-bil-V和ALB與對照無顯著差異，TP和TC呈現上升趨勢，說明肝臟的合成和儲存功能未受到影響。肝臟AST和ALP能夠反映肝細胞損傷，當肝臟受到損傷時引起AST和ALP升高，已有研究報道松浦鏡鯉(songpumirrorcarp)體內ALP的含量也隨溫度的升高而增加[19]。本試驗中48 h和96 h AST高于對照組，而ALP均顯著高于對照組，說明溫度升高造成哲羅魚肝損傷，影響部分肝功能。CREA-S是多數魚類嘌呤代謝的終產物，常被用來評估魚類鰓和腎臟的功能[20]。血清CREA-S的濃度變化主要由腎小球的濾過能力(腎小球濾過率)來決定，可在一定程度上準確反映腎小球濾過功能的損害程度，腎功能正常時，CREA-S排出率恒定，當腎實質受到損害時，腎小球的濾過率就會降低，CREA-S濃度升高。本試驗中CREA-S含量表現先下降后上升的趨勢，0 h顯著低于對照組，24 h與對照組無顯著差異，48 h時顯著高于對照組，說明高溫脅迫對哲羅魚腎臟造成了損傷。同時魚體內代謝產物CO2在血漿中富集會導致血漿酸化，降低血液的攜氧能力和血紅蛋白對氧氣的親和力[21,22]，因此實驗過程中CO2呈現下降趨勢，以增加血液的攜氧能力和血紅蛋白對氧氣的親和力，保證魚體供氧。CK和AST是心臟功能的重要檢測指標，CK主要存在于細胞質和線粒體中，是一個與細胞內能量運轉、肌肉收縮、ATP再生有直接關系的重要激酶[23]。CK下降說明甲狀腺功能亢進，是由于甲狀腺合成釋放過多的甲狀腺激素，造成機體代謝亢進和交感神經興奮。AST主要分布在心肌，其次是肝臟、骨骼肌和腎臟等組織中[24]。正常狀態(tài)下血清中的AST含量較低，但相應細胞受損時，細胞膜通透性增加，胞漿內的AST釋放后進入血液，導致血清濃度升高。大黃魚的CK和AST在32.0 ℃高溫下持續(xù)7 d后的含量顯著高于適溫組，顯示高溫造成大黃魚心功能障礙[25]。本試驗中，當溫度升至26.0 ℃時，CK和AST均顯著性降低，CK先下降、后上升，均顯著低于對照組，持續(xù)熱刺激48 h開始回升，但不回升到正常水平；AST在48 h回升至正常水平，表明溫度升至26.0 ℃對哲羅魚心臟造成損傷，但隨著時間增加損傷程度沒有加劇且逐漸恢復，可見哲羅魚在26.0 ℃高溫脅迫過程中心臟具有一定的適應能力。

熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)是由機體受傷、紫外線暴露、受寒、組織修復等各種應激誘導表達的蛋白[26]，是動物體處于應激狀態(tài)時所誘導產生的蛋白質分子伴侶，具有阻止蛋白質發(fā)生錯誤折疊和聚集，穩(wěn)定胞內蛋白構象，介導蛋白質到達目標細胞器的功能[26]。有研究報道生物體在受到外界寒冷和高溫等刺激時，各組織細胞的熱休克蛋白的表達都有不同程度的增加[27]，大量表達的hsp60、hsp70和hsp90可增強細胞對熱應激的耐受性，提高細胞的存活率，保護機體不受或少受損害[28]。因此在受到高溫脅迫時理論上哲羅魚各組織hsp60、hsp70和hsp90的表達量均應上升，但綜合各組織表達結果發(fā)現，高溫脅迫時在哲羅魚的血液、心臟和腦中hsp60和hsp90基因較hsp70基因變化明顯，二者均有部分時間點表達量顯著高于對照組；而在肝臟中hsp60未有顯著變化，hsp70和hsp90卻顯著低于對照組，推測高溫脅迫肝臟先受到損傷，26 ℃已經超出了哲羅魚的耐受能力，解剖發(fā)現肝臟發(fā)白，血清中ALP升高，說明高溫使哲羅魚肝臟受到嚴重損傷，失去了相應的調節(jié)功能，這與肝功能指標結果一致；此時血液、心臟和腦hsp60和hsp90表達量增加，做出相應的調節(jié)，以緩解魚體對溫度的不適。

本研究發(fā)現哲羅魚在26.0 ℃維持不同時間血液生理生化指標變化過程及相關熱應激蛋白基因在血液、心、腦和肝臟組織中的表達情況。高溫時哲羅魚體內供氧相關的紅細胞和血紅蛋白增加，維持魚體耗氧；淋巴細胞上升，魚體處于免疫狀態(tài)，但非特異免疫的中性粒細胞和單核細胞功能受到抑制。肝功能指標顯示ALP增高，腎功相關CREA-S含量表現先下降后上升的趨勢，心臟功能的CK先下降、后上升，說明肝功能和腎功能在一定程度上受到一定損傷，心功能在26.0 ℃持續(xù)一段時間后得到恢復。由于肝受到損傷，已經失去了熱休克蛋白調節(jié)功能，血液、心臟和腦中部分熱應激蛋白表達量增加以緩解魚體不適。本研究為哲羅魚熱應激機制相關研究及耐高溫新品種培育提供理論依據。