周文博，褚志鵬，李羅新,，劉 偉，陳細華﹡，柴 毅，洪宇聰，孫凱輝

(1.長江大學動物科學學院，湖北荊州 434025;2.中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223;3.廣東越群海洋生物研究開發(fā)有限公司，廣東揭陽 522000)

磷是魚類生長所必需的重要常量礦物元素。魚類雖然可以直接吸收自然水體中的磷，但水體中磷含量有限且吸收率低，無法滿足魚類正常生長需要，因而飼料是人工養(yǎng)殖魚類的主要磷源[1]。飼料中的磷來源于飼料原料中的磷及添加的無機磷，而飼料總磷中可被動物利用的部分稱之為有效磷[2]。飼料中磷不足，會導致魚類生長緩慢、飼料效率低，甚至造成魚體脂肪異常積累[3-4]。但磷含量過多時，魚體中磷的利用率不高會導致未被利用的磷和尿磷排泄到環(huán)境中引起水體富營養(yǎng)化[5]。目前關于魚類磷需要量已有一些研究，結果表明魚類有效磷需求量在0.51%～0.96%[6-10]，這說明不同魚類對飼料有效磷需求量差異較大。

鱘魚是鱘形目魚類的俗稱，2019年我國鱘魚養(yǎng)殖年產(chǎn)量約為10萬噸，但其配合飼料和營養(yǎng)參數(shù)方面的研究仍較為薄弱[11-14]。市場上生產(chǎn)的商品飼料一般通過添加磷酸二氫鈣來滿足魚體對磷的需求且磷含量普遍較高，相關檢測報道鱘魚商品飼料總磷含量在1.55%～1.74%[15]，高于已知的施氏鱘(Acipenserschrenckii)(0.88%～1.00%)[16]、西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)(0.50%～0.87%)[17]和雜交鱘(Husohuso♀×A.schrenckii♂)(0.63%～1.15%)[18]的總磷需求量。不僅造成資源的浪費同時也不利于鱘魚產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。雜交鱘(西伯利亞鱘♀×施氏鱘♂)俗稱西雜，是目前國內(nèi)商品鱘養(yǎng)殖市場中養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的品種[19]。鑒于此，本實驗以西雜為研究對象探討飼料不同有效磷水平對其生長性能、飼料利用、體成分和部分血清生化指標的影響，旨在確定雜交鱘飼料有效磷的需要量，為優(yōu)化鱘魚飼料配方提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

以魚粉、明膠和干酪素為蛋白源，魚油和大豆油為脂肪源，糊精為糖源，磷酸二氫鈣為磷源配制有效磷水平(實測值)為0.37%(Diet1)、0.65%(Diet2)、0.96%(Diet3)、1.22%(Diet4)和1.48%(Diet5)的5組等氮等能飼料(表1)。原料經(jīng)粉碎后過60目篩，按表1比例精準稱重(0.1 g)充分混勻，含量較低(<5%)的原料采用逐級預混法混勻,用飼料加工設備(浙江民益食品機械有限公司，32型制粒機)制成直徑約為2.0 mm條狀飼料，并烘干(50℃)破碎后，將飼料密封放入-20 ℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 實驗飼料配方及成分含量Tab.1 Formulation and proximate composition of the experimental diets %

表2 飼料中的有效磷含量Tab.2 Dietary available phosphorus levels %

1.2 實驗魚來源與飼養(yǎng)管理

實驗魚購自荊州市漁都特種水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，并在該公司基地室內(nèi)流水養(yǎng)殖系統(tǒng)進行養(yǎng)殖實驗。正式實驗開始前飼喂對照組飼料馴化實驗魚2周，使其適應飼料和養(yǎng)殖環(huán)境。2周后，挑選規(guī)格齊整、健康的實驗魚330尾，平均體質(zhì)量為(10.06±0.39)g，隨機平均分配到15個直徑0.78 m，高0.3 m，容量為140 L的圓柱形聚乙烯養(yǎng)殖桶，每桶放魚22尾。實驗設5個處理組，每組設3個重復。實驗期間每天表觀飽食投喂3次(7:00，12:00，18:00)，每次投喂結束0.5 h后用虹吸法收集成型的糞便并進行換水。養(yǎng)殖周期為8周。每天記錄實驗魚攝食和死亡情況，每2周對魚體重進行稱量。養(yǎng)殖用水為充分曝氣的地下水，養(yǎng)殖期間水溫19.2～20.9 ℃，溶氧質(zhì)量濃度6.90～7.69 mg/L，pH 7.6～8.0，氨氮質(zhì)量濃度<0.10 mg/L。

1.3 樣品的采集與測定方法

養(yǎng)殖結束時，將每個養(yǎng)殖桶的實驗魚稱重、計數(shù)，用以計算增重率、特定生長率和成活率。每桶隨機取3尾魚用MS-222(120 mg/L)麻醉后，測量體重與體長，用以計算肥滿度，隨后將實驗魚解剖取肝臟和內(nèi)臟稱重，用以計算肝體比和臟體比。統(tǒng)計每個重復飼料的飼料攝入量，用以計算飼料效率和蛋白質(zhì)效率。將每個重復的糞便收集于樣品袋中放-20 ℃冰柜保存，經(jīng)冷凍干燥及粉碎后測定飼料磷表觀消化率(ADCP)。指標的計算公式如下：

增重率(WGR)=(Wt-W0)/W0×100%；

特定生長率(SGR)=(lnWt-lnW0)/t×100%；

存活率(SR)=Nt/N0×100%；

飼料效率(FE)=(Wt-W0+Md)/f×100%；

蛋白質(zhì)效率(PER)=(Wt-W0)/Pt×100%；

臟體比(VSI)=Wv/W×100%；

肝體比(HSI)=Wh/W×100%；

肥滿度(CF)=W/(BL)3×100；

磷表觀消化率(ADCP)=[1-(Tid×Pf)/(Pd×Tif)]×100%

式中，Nt為終末尾數(shù)；N0為初始尾數(shù)；Wt為終末體質(zhì)量(g)；W0為初始體質(zhì)量(g)；W為魚體重；t為實驗天數(shù)(d)；Wh為肝臟重(g)；Wv為內(nèi)臟重(g)；f為總攝食飼料干重(g)；Md為終末每個養(yǎng)殖箱的總死亡質(zhì)量(g)；BL為終末體長；Tid為飼料中TiO2含量；Pf為糞便含磷量；Tif為糞便TiO2含量；Pd為飼料含磷量。

將實驗魚饑餓24 h處理后，每個養(yǎng)殖桶隨機取3尾魚，用MS-222(120 mg/L)麻醉后，取背部肌肉和背、側、腹骨板；再用微波爐處理加熱至魚體熟化后，分離脊柱，干燥，搗碎后去脂制備脫脂干骨[20]。另外從每個養(yǎng)殖桶中再取3尾魚，麻醉后，放-20 ℃冰柜保存用以測定全魚常規(guī)營養(yǎng)成分。全魚、肌肉和飼料常規(guī)營養(yǎng)成分含量測定時，水分采用105 ℃干燥法測定(GB/T 5009.3-2003)。粗蛋白質(zhì)采用凱氏定氮法測定(GB/T 5009.3-2003)。粗脂肪采用索氏抽提法測定(GB/T 5009.6-2003)。粗灰分采用550 ℃灼燒法測定(GB/T 5009.4-2003)。飼料、骨板和脊椎磷含量采用分光光度法(GB/T 6437-2018)。飼料鈣含量采用原子吸收光譜法(GBT 13885-2017)測定。血清生化指標采用全自動生化分析儀(BS-460，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)測定。飼料和糞便中的二氧化鈦(TiO2)含量采用酸消化法、原子吸收分光光度計測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結果

2.1 飼料有效磷水平對雜交鱘幼魚生長性能和飼料利用的影響

由表3可知，在本實驗中，各組實驗魚的成活率均較高且無顯著差異。隨飼料中有效磷水平由0.37%增加至0.96%，實驗魚的增重率和特定生長率顯著升高，但當飼料有效磷水平達到0.96%后實驗魚的生長速度減緩，0.96%、1.22%和1.48%組的實驗魚的增重率和特定生長率顯著高于0.37%組和0.65%組。各實驗組飼料效率和蛋白質(zhì)效率隨著飼料有效磷水平的增加均呈先升高后降低趨勢，對照組實驗魚的飼料效率和蛋白質(zhì)效率顯著低于其他各組，且飼料有效磷水平0.96%組的飼料效率和蛋白質(zhì)效率最高。飼料中不同有效磷水平對各實驗組魚肝體比、臟體比和肥滿度均無顯著影響。以雜交鱘幼魚增重率為因變量(Y)，以飼料有效磷水平為自變量(X)，進行折線回歸分析得出Y=368.46-385.53 (0.93-X) (R2=0.995 2)，當X=0.93%時，增重率達到最大值(圖1)。

表3 飼料有效磷水平對雜交鱘幼魚生長的影響Tab.3 Effect of dietary available phosphorus levels on growth performance of juvenile hybrid sturgeon

圖1 飼料有效磷水平對雜交鱘幼魚增重率的影響Fig.1 Effect of dietary available phosphorus levels on weight gain rate of juvenile hybrid sturgeon

2.2 飼料有效磷水平對雜交鱘幼魚體成分的影響

由表4可知，各實驗組全魚水分和粗蛋白含量無顯著差異。隨飼料中有效磷水平增加，全魚粗脂肪含量顯著降低，對照組的全魚粗脂肪含量顯著高于其他組。全魚粗灰分和磷含量隨飼料有效磷水平增加均呈現(xiàn)先升高后趨于平穩(wěn)趨勢，0.96%、1.22%和1.48%實驗組全魚粗灰分和磷含量顯著高于0.37%組和0.65%組。當飼料中有效磷水平為0.96%時，全魚粗灰分含量最高，而全魚磷含量在飼料有效磷水平1.22%組達到最大值。飼料中添加不同有效磷水平對實驗魚肌肉水分、粗蛋白、粗灰分和磷含量均無顯著影響，肌肉粗脂肪含量隨飼料有效磷水平增加呈降低趨勢但無顯著性差異。以雜交鱘幼魚全魚磷含量為因變量(Y)，以飼料有效磷水平為自變量(X)，進行折線回歸分析得出Y=0.392 6-0.220 3(1.02-X) (R2=0.999 8)，當X=1.02%，魚體磷含量最高(圖2)。

表4 飼料有效磷水平對雜交鱘幼魚體組成的影響Tab.4 Effects of dietary available phosphorus levels on body content of juvenile hybrid sturgeon %

圖2 飼料有效磷水平對雜交鱘幼魚全魚磷含量的影響Fig.2 Effect of dietary available phosphorus levels on whole-body phosphorus content of juvenile hybrid sturgeon

隨飼料有效磷水平的增加，脊椎粗灰分和磷含量呈先升高后趨于平穩(wěn)趨勢。飼料有效磷水平由0.37%增加至0.96%，脊椎粗灰分和磷含量顯著增加，當飼料有效磷水平達到0.96%后實驗魚的脊椎粗灰分和磷含量趨于平穩(wěn)。0.96%、1.22%和1.48%組脊椎粗灰分和磷含量均顯著高于0.37%組和0.65%組。以雜交鱘幼魚脊椎磷含量為因變量(Y)，以飼料有效磷水平為自變量(X)，進行折線回歸分析得出Y=2.096 6-0.801 9(0.95-X) (R2=0.977)，當X=0.95%，脊椎磷含量最高(圖3)。

圖3 飼料有效磷水平對雜交鱘幼魚脊椎磷含量的影響Fig.3 Effect of dietary available phosphorus levels on vertebrae phosphorus content of juvenile hybrid sturgeon

2.3 飼料有效磷水平對雜交鱘幼魚血清生化指標的影響

由表5可知，隨著飼料中有效磷水平的增加，實驗魚血清中磷含量顯著升高，當有效磷水平達到0.96%后趨于平穩(wěn)，且對照組的血清磷含量顯著低于其他各組；血清中鈣含量呈先升后降的趨勢，但差異不顯著。堿性磷酸酶活性隨飼料有效磷水平的增加呈先升高后趨于平穩(wěn)趨勢，對照組的堿性磷酸酶活性顯著低于其他組。

3 討論

3.1 飼料有效磷水平對實驗魚生長性能和飼料利用的影響

已有研究表明低磷水平飼料會導致實驗魚生長緩慢以及飼料效率降低[1,4]。本實驗中飼料有效磷水平較低的組(0.37%)雜交鱘也出現(xiàn)了生長緩慢及飼料效率低等癥狀。Yu等[8]和Schamber等[21]研究認為飼料中有效磷水平較低時，磷主要被用于魚體生理代謝過程，故生長所需的磷不足導致魚體從飼料蛋白中攝取的氨基酸未被充分利用形成體蛋白，而是通過聯(lián)合脫氨作用被代謝，從而使得魚體生長受阻。Wang等[22]研究發(fā)現(xiàn)牙鲆(Paralichthysolivaceus)缺磷會出現(xiàn)食欲差和頭部畸形等癥狀。

表5 飼料有效磷水平對雜交鱘幼魚血清生化指標的影響Tab.5 Effect of dietary available phosphorus levels on some serum biochemical indexes of juvenile hybrid sturgeon

Roy等[23]研究也表明低磷水平飼料組黑線鱈(MelanogrammusaeglefinusL.)食欲和活力極差且出現(xiàn)脊椎彎曲癥狀。但本實驗中并未發(fā)現(xiàn)類似的問題，這可能與本實驗對照組飼料中含有少量磷有關[16]。同樣，有研究表明飼料中過量的磷會與其他礦物質(zhì)形成復合物抑制魚體對微量元素吸收并導致生長速度的減緩[3]。在本實驗中飼料有效磷水平最高的實驗組并未發(fā)現(xiàn)實驗魚的生長受到明顯抑制，這表明本實驗中雜交鱘可以耐受1.48%的有效磷水平。以增重率為指標，通過折線回歸分析得出實驗魚對飼料有效磷需要量為0.93%，這與施氏鱘[16]的總磷需求量(1.00%)相近。但低于雜交鱘[(歐洲鰉(Husohuso)♀×施氏鱘♂)[18](494.21±18.63) g]飼料中總磷需求量(1.15%)，分析原因可能是魚種規(guī)格的不同所造成的。然而，Xu等[17]研究發(fā)現(xiàn)以磷酸二氫鈉為磷源在室內(nèi)循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)條件下得出西伯利亞鱘的飼料總磷需求量為0.50%，低于本實驗結果0.93%。這可能是由于魚體對飼料不同磷源利用率及養(yǎng)殖環(huán)境的不同從而造成了魚體對飼料磷的需求量有所差異[3,8]。

飼料效率和蛋白質(zhì)效率可有效反映魚類對飼料及其中蛋白質(zhì)利用情況[24]。本實驗中，飼料有效磷水平由0.37%增加至0.96%時，各實驗組飼料效率和蛋白質(zhì)效率顯著升高。這可能是飼料有效磷水平的增加升高了羧肽酶的活性從而改善了魚體對飼料中蛋白質(zhì)的消化吸收能力[25]。而當飼料有效磷水平繼續(xù)增加至1.48%時，飼料效率和蛋白質(zhì)效率出現(xiàn)下降趨勢。這與黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[26]和印度囊鰓鯰(Heteropneustesfossilis)[27]的研究結果類似，說明實驗魚在對飼料的攝食及消化吸收存在著上限，即存在一個最適磷水平能顯著提高魚體對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用[8]。因此，過高的飼料磷水平不但難以使魚體獲得最佳的生長速度和飼料利用率，而且會造成飼料的浪費，增加養(yǎng)殖成本[28]。

3.2 飼料有效磷水平對實驗魚體成分的影響

飼料磷水平是影響魚體脂肪含量的重要因素，飼料磷水平較低時會造成魚體脂肪的大量沉積[4]。Zafar等[27]研究也發(fā)現(xiàn)飼料中有效磷水平增加會引起印度囊鰓鯰魚體脂肪含量降低。同樣的，在本實驗中全魚粗脂肪含量與飼料有效磷水平呈負相關，對照組的魚體脂肪含量顯著高于0.65%～1.48%組，這與對鯽[9]的研究結果一致，說明有效磷水平增加可促進魚體脂肪的氧化代謝、保障其能量的需求，從而減少魚體脂肪的沉積[29]。Liang等[1]對草魚(Ctenopharyngodonidella)的研究認為飼料中有效磷的缺乏會降低魚體的氧化磷酸化作用從而阻礙了機體的三羧酸循環(huán)(TCA)和體內(nèi)乙酰CoA的堆積，抑制脂肪酸的β氧化，阻礙脂肪的供能，導致脂肪的沉積；當飼料有效磷水平增加后，魚體內(nèi)脂肪酸的β氧化增強，脂肪的供能作用加強，進而使魚體脂肪沉積降低。

水產(chǎn)動物機體組織中粗灰分和磷含量的變化常用作其營養(yǎng)研究的評價指標[30]。飼料有效磷水平由0.37%增加至1.48%，全魚粗灰分和磷含量均呈先升高后趨于平穩(wěn)的趨勢。這與團頭魴(Megalobramaamblycephala)[3]和吉富羅非魚(GIFTOreochromisniloticus)[29]的研究結果一致，說明飼料中高水平的有效磷促進了魚體礦物質(zhì)的積累[31]?；曳值脑黾涌赡苁枪趋老到y(tǒng)、鱗片快速生長發(fā)育的結果[32]。魚體內(nèi)約85%的磷儲存于骨骼中，而骨骼參與磷代謝，脊椎骨中磷含量可作為確定飼料中適宜的磷水平的指標[33]。在本實驗中，飼料有效磷水平顯著影響了實驗魚脊椎粗灰分和磷含量，并與之呈一定的正相關。在哲羅魚(Huchotaimen)[5]的研究中也有相似結果，這表明增加飼料中的有效磷可促進魚體骨骼中磷代謝和沉積[17]。通過折線回歸分析全魚磷含量得出實驗魚飼料有效磷的需求量為1.02%，略高于最佳生長的有效磷需求量。這可能是由于以生長作為變量來評估營養(yǎng)物質(zhì)的需求依賴于實驗的時間，隨著實驗時間的延長，基于生長指標評估所得的磷需求量將趨近于以機體組織磷沉積為評估指標所得的磷需求量[34]。而本實驗中以實驗魚脊椎磷含量為評價標準得到的有效磷需求量幾乎與最佳生長的有效磷需求量相等，這與印度囊鰓鯰[27]和黃鱔[4]等硬骨魚類研究結果不同。有研究者推測鱘魚是軟骨魚類，其脊椎磷含量本來就比硬骨魚類要低[17,35]。

在本實驗中并未發(fā)現(xiàn)飼料有效磷水平對雜交鱘幼魚的肌肉粗蛋白、粗脂肪、水分、粗灰分和磷含量有顯著影響，同樣的結果也出現(xiàn)在施氏鱘[16]的研究中，這可能與魚體肌肉對磷缺乏或富余的敏感性較低有關[36]。

3.3 飼料有效磷水平對實驗魚血清生化指標的影響

血清生化指標能反映機體血液中營養(yǎng)成分和生理代謝狀況的變化，血清中磷含量可以大致了解機體內(nèi)的磷吸收和利用的情況，也是評價魚體磷水平的指標[27,37]。在本實驗中，飼料有效磷水平由0.37%增加至0.96%，血清中的磷含量顯著升高，在鯽魚[9]的研究中也有類似的結果，這表明增加飼料中有效磷水平有利于魚體磷的吸收和利用[1]。當飼料有效磷水平達到0.96%后繼續(xù)增加有效磷水平，血清磷含量無顯著差異，說明0.96%的有效磷水平促使魚體腸道和腎臟對磷的吸收機制達到飽和，此時進一步增加有效磷水平導致魚體內(nèi)的可溶性磷以尿磷的方式進行排泄以維持血清中磷含量的穩(wěn)定[4]。也有研究認為魚體內(nèi)存在著磷的穩(wěn)態(tài)機制且血清磷含量達到一定水平即可激活此機制，并通過調(diào)節(jié)腎臟合成1,25-二羥維生素D3的速度從而調(diào)控魚體磷的吸收和骨骼的礦化速率[38]。因此有必要對磷的穩(wěn)態(tài)機制進一步的研究。本實驗中飼料有效磷水平的增加未顯著影響各組血清鈣含量，與澳洲銀鱸(Bidyanusbidyanus)[39]的研究結果一致。Song等[40]研究發(fā)現(xiàn)魚類可以通過鰓上皮細胞和皮膚直接吸收周圍水體中的鈣，同時攝食的飼料含有充足的鈣使得血清鈣含量穩(wěn)定，這可能是本實驗中血清鈣含量無顯著差異的原因。

堿性磷酸酶主要由成骨細胞和肝臟合成分泌，參與魚體骨骼的礦物質(zhì)代謝并控制細胞膜的運輸活性，其活性與機體鈣磷代謝強度緊密相關，可作為衡量肝臟和骨骼代謝狀況指標[41]。本實驗結果顯示，飼料有效磷水平由0.37%增加至0.96%，魚體血液中的堿性磷酸酶活性顯著升高。這表明飼料中有效磷水平的增加可以提高魚體堿性磷酸酶活性，促進磷代謝及利用[3]。但飼料有效磷水平繼續(xù)增加并未提高1.22%組和1.48%組魚體血液中堿性磷酸酶的活性。Zhang等[42]研究發(fā)現(xiàn)過高的飼料有效磷水平減緩了花鱸(Lateolabraxjaponicus)骨骼的礦化和鈣磷代謝，這也可能是1.22%組和1.48%組實驗魚血清堿性磷酸酶活性不再升高的原因。這與實驗魚脊椎骨粗灰分和磷含量的結果相對應。此外，血液中的堿性磷酸酶活性易受多種因素影響，如溫度、攝食量、生長階段等[43]。也有研究表明飼料磷水平的增加會降低黑鯛(Sparusmacrocephalus)[30]和澳洲銀鱸[39]的堿性磷酸酶的活性。有關飼料磷水平對魚體血液堿性磷酸酶活性影響的原因有待于進一步研究探討。

4 結論

綜上所述，在本實驗條件下，綜合考慮雜交鱘幼魚的生長、魚體營養(yǎng)成分、脊椎骨磷含量及血清生化指標，建議雜交鱘幼魚飼料有效磷水平在0.93%～1.02%。